血細胞計數(shù)板計數(shù)藻細胞密度是一種常用的計數(shù)方法。下面介紹用血細胞計數(shù)板計數(shù)藻細胞密度的操作步驟。

血細胞計數(shù)板的結構；

血細胞計數(shù)板由優(yōu)質厚玻璃制成，每個計數(shù)板通過H形凹槽分成兩個相同的計數(shù)細胞。計數(shù)池兩側有支撐柱，用專用蓋玻片覆蓋，形成高度為0.1mm(以下)的計數(shù)池:

計數(shù)分為25個中間方塊，每個中間方塊又分為16個小方塊。計數(shù)區(qū)的邊長為1mm，面積為lmm2，每個小方塊的面積為1/400mm2。

蓋玻片蓋好后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個小方塊的體積為1/4000 m3(下):

計算面積-紅色區(qū)域由16個1/400的小方塊組成

計算步數(shù):

1.取一塊干凈的血細胞計數(shù)板，用蓋玻片覆蓋計數(shù)區(qū)。

2.用20μl移液管吸取Lugol固定液固定的藻液(如果濃度過高，稀釋)，從計數(shù)板中間平臺兩側的凹槽沿蓋玻片下緣滴一小滴(如下圖):

樣品添加示意圖

3.讓細胞沉淀在計數(shù)板上，不再隨液體漂移。將血細胞計數(shù)板放在顯微鏡臺上，并夾緊。找到低倍顯微鏡下的計數(shù)區(qū)后，切換到高倍顯微鏡。

4.計算下圖中的區(qū)域(25個區(qū)域中的5個)。

紅色部分顯示實際計數(shù)區(qū)域

5.每個樣品重復計數(shù)3份。

6.計算。計算公式如下:

注意事項:

1.為了保證計數(shù)的準確性，避免重復計數(shù)和丟失記錄，計數(shù)時對網(wǎng)格線上的單元格的統(tǒng)計有統(tǒng)一的規(guī)定。比如，藻類細胞位于一個大格子的雙線上，計數(shù)的時候會對上面的線、下面的線、左邊的線、右邊的線進行計數(shù)，減少誤差。也就是說，這個格子的上、左線上的單元格在這個格子里算，而這個格子的下、右線上的單元格在這個格子里不算(下圖):

計數(shù)規(guī)則示意圖

2.為了清理計數(shù)視野，可以在水中加入一些染料或過濾器。顯微鏡下對比度會更大。不要用投影光源反射光線。

3、只取樣幾微升，用移液管。

4.使用血細胞計數(shù)板一段時間后，顯微鏡下看不清網(wǎng)格。每次使用后，用稀鹽酸或酒精清洗。

5.先蓋膜，再滴樣品，然后用吸水紙吸住，會使藻類在計數(shù)室內均勻沉降，計數(shù)時誤差會很小。如果蓋玻片與樣品溶液接觸，計數(shù)板上的藻類分布會改變位置，變得不均勻。

6.血細胞計數(shù)板專用蓋玻片不同于普通蓋玻片。血液蓋玻片的規(guī)格是22*26*0.5mm，最常用的蓋玻片是18*18*0.2mm，還有20*20*0.2mm，22*22*0.2mm，24*24*0.2mm，不能用普通蓋玻片

(1)重量不同，用血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理是單位體積的細胞數(shù)。取樣后，應保證槽內體積為0.1微升，如果太輕，蓋玻片可能會漂浮，從而影響總體積，導致計數(shù)不準確。

(2)邊長可以不同。由于計數(shù)板中心的兩排凸出部分比兩端低，如果蓋玻片不夠長，由中心而不是兩端支撐，導致取樣后液體高度(正常1/250mm)發(fā)生變化，從而影響總體積，計數(shù)不準確。

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