旋毛蟲病是人類和動物共同患的寄生蟲病，旋毛蟲發(fā)現(xiàn)已有170多年，進(jìn)行旋毛蟲檢查已有140多年，但這種病不僅尚未得到完全有效的控制，而且發(fā)生范圍反而擴(kuò)大，成為一種全球性疾病，嚴(yán)重?fù)p害了人體健康，給畜牧業(yè)和食品工業(yè)帶來了重大經(jīng)濟(jì)損失。

旋毛蟲病被我國列為二類動物疾病。因此控制和消滅旋毛蟲病是醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)學(xué)的一個重要問題。

在旋毛蟲被顯微鏡檢出之前，人畜旋毛蟲病無疑已存在數(shù)千年。1835年，倫敦的醫(yī)學(xué)生Paget第一次從人體中發(fā)現(xiàn)了旋毛蟲，同年Owen正式發(fā)表了旋毛蟲的報道，并將其命名為旋毛蟲（Trichinella spiralis）。1846年Leidy從豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)旋毛蟲。1845年Herbst描述了鼠體內(nèi)的旋毛蟲包囊，并于1850年證實(shí)旋毛蟲可通過肉在動物間傳播。1855年Leuckart證明幼蟲可在動物腸道中

發(fā)育為成蟲。1859年，Zenker發(fā)現(xiàn)首例因旋毛蟲病死亡的患者。

由于旋毛蟲早期在德國廣泛流行，危害十分嚴(yán)重，所以德國對旋毛蟲病采取防制措施的時間較早。在馬格德堡，法律明文禁止銷售病肉，群眾對生食豬肉的危險性家喻戶曉。1860年Zenker描述人體致死病例。Virchow在德國倡導(dǎo)對豬肉進(jìn)行顯微鏡鏡檢，1863年開始對屠宰豬進(jìn)行旋毛蟲檢驗(yàn)，1866年對屠宰豬進(jìn)行旋毛蟲檢驗(yàn)在德國正式實(shí)行。到19世紀(jì)末，屠宰豬進(jìn)行旋毛蟲鏡檢已在德國及大多數(shù)西歐國家普遍推廣。美國于1898年開始進(jìn)行豬肉的顯微鏡檢查，1967年Zimmermann提出用人工胃液消化肌肉法檢查。德國在Zenker發(fā)現(xiàn)旋毛蟲致病性后的30年內(nèi)，報道人體旋毛蟲病例多達(dá)14817個。我國于1881年、1934年在豬、犬及貓體內(nèi)檢獲到旋毛蟲，直至1964年西藏首次報道了旋毛蟲人體感染，此后云南、河南、吉林、遼寧、湖北、廣西等均有報道。

1 病原學(xué)特征

旋毛蟲又稱旋毛形線蟲，屬線形動物門、線蟲綱、咀刺目、毛形線蟲科、毛形線蟲屬。過去一直

認(rèn)為旋毛蟲病的病原只有1種，即Trichinella spivalis。目前國際上傾向于5種，即Trichinella spiralis、Trichinella nativa、Trichinella britovi、Trichinella pseudospiralis和Trichinella nelsoni。加拿大、波蘭、保加利亞、西班牙及荷蘭等國家的學(xué)者證明偽旋毛蟲與旋毛蟲在形態(tài)學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和病理學(xué)上都有明顯區(qū)別。偽旋毛蟲外形細(xì)長，雌蟲長3～5mm，前端較細(xì)，雄蟲長度僅及雌蟲之半。旋毛線蟲的成蟲細(xì)小，前部較細(xì)，后部較粗，雌雄異體，雄蟲大小為（1.4～1.6）mm×（0.04～0.05）mm，雌蟲為（3～4）mm×0.06mm。

成蟲的消化道簡單，包括口、咽、食管、腸管和肛門。蟲體食管的前部無食管腺圍繞，其后部全被一列相連的食管腺細(xì)胞所包圍。肛門在蟲體的尾端腹面。

雌、雄成蟲的生殖器官均為單管型，腸管和生殖器官均在蟲體較粗的后部。雄蟲的尾端有泄殖孔，其外側(cè)有2枚鐘狀（耳狀懸垂）的支配葉，沒有交合刺。雌蟲的陰門位于蟲體前部（食管部）的腹面中央。卵胎生，蟲卵在雌蟲子宮內(nèi)發(fā)育，于近陰道處孵出幼蟲。

肌旋毛蟲的包囊很小，可以長至0.25～0.50mm，在豬肉內(nèi)多為梭形，其長軸與肌纖維平行，有兩層壁，囊內(nèi)含1條幼蟲，但少數(shù)也含6～7條的。6個月后，包囊增厚，囊內(nèi)開始鈣化，只有鈣化到蟲體時蟲體才能死亡，否則幼蟲可長期生存，壽命可長達(dá)25年。成蟲和幼蟲雖同時寄生于同一寄主體內(nèi)（該寄主既是終寄主，又是中間寄主），但幼蟲必須被另一寄主吞食后，才能在新的寄主體內(nèi)完成其生活史而發(fā)育為成蟲。

2 流行病學(xué)特征

旋毛蟲病呈世界性分布，全球七大洲除南極洲因無定居的居民而無旋毛蟲外，其余六大洲均發(fā)現(xiàn)有旋毛蟲病，但以歐洲、北美洲發(fā)病率較高。在歐洲國家，18—19世紀(jì)曾嚴(yán)重流行。如1860—1890年本病僅在德國就暴發(fā)了100多次，每次暴發(fā)患者30多人，平均死亡率為5％；自1975年在意大利因食用馬肉而引起人體旋毛蟲病暴發(fā)以來，在法國和意大利共發(fā)生了13次因食用馬肉而致的暴發(fā)（法國8次，意大利5次），患者達(dá)3200多人，死亡率為0.31％；英國自20世紀(jì)70年代以來曾3次暴發(fā)人旋毛蟲病。在美洲國家，美國旋毛蟲的感染率為4％，有的城市感染率也高達(dá)12％～14％；在亞洲國家，豬旋毛蟲病在我國和泰國嚴(yán)重流行，散發(fā)的人體旋毛蟲病多見于東南亞的國家，如柬埔寨、印度尼西亞、老撾、馬來西亞、老撾等。在非洲國家，家養(yǎng)動物旋毛蟲病僅見于埃及的豬和犬，野生動物旋毛蟲病的病原體為納氏旋毛蟲；人體納氏旋毛蟲感染約報道有100例，來自肯尼亞、坦桑尼亞、塞內(nèi)加爾及埃塞俄比亞。我國自1964年西藏首次報道人感染旋毛蟲病例以來，至1997年年底，在15個省份的93個縣（市）共發(fā)生了558起旋毛蟲病例，發(fā)病23419人，其中死亡238人。同期云南省旋毛蟲病共暴發(fā)441次，發(fā)病20101人，死亡213人。

旋毛蟲的宿主特異性極差，幾乎所有哺乳動物均可感染，某些鳥類也能感染，但不同種類的動物對旋毛蟲的易感性不一樣，截至目前，至少已報道150多種哺乳動物可自然感染旋毛蟲。在我國，旋毛蟲感染率較高的動物有豬、犬、貓、狐和某些鼠類。許多昆蟲如蠅蛆吞食動物尸體中的旋毛蟲包囊，能使包囊感染力保持6～8d，鳥類肌組織雖不感染旋毛蟲，但當(dāng)食入帶有旋毛蟲的肉后，可隨糞便排出有活力的旋毛蟲幼蟲，使鼠感染，所以鳥類如烏鴉、鷹等對旋毛蟲傳播也有作用。食腐肉可能是野生動物主要的感染方式。這些動物之間相互殘殺或攝食尸體而形成的“食物鏈”成為人類感染的自然疫源。隨著人們生活水平的提高，感染旋毛蟲的犬肉及野生動物肉品特別是野豬、熊等動物已成為人感染旋毛蟲的又一重要來源。

人體最重要的感染方式是食生的或加工不徹底的含有活幼蟲的動物肉，主要是豬肉及其制品和野生動物肉。因?yàn)樨i肉是人們最主要的肉食品，故含旋毛蟲的豬肉是人體旋毛蟲病的主要感染源。豬的感染主要是由于吞食了含活動蟲囊包的肉屑或食入未經(jīng)煮沸或煮沸不充分的幼蟲肉渣。由于人的不良衛(wèi)生習(xí)慣，通過屠宰、銷售、運(yùn)輸、烹調(diào)、加工等環(huán)節(jié)，連同屠宰廢水、血液、肉、副產(chǎn)品、污染的用具等把旋毛蟲散播到各個地方，又由于人們將以上材料作為養(yǎng)豬的飼料和用水，使豬感染旋毛蟲。此外，在屠宰場、肉攤、加工廠附近采食了拋棄的廢肉、洗肉水等同樣可使豬感染旋毛蟲。旋毛蟲幼蟲囊包的抵抗力較強(qiáng)，能耐低溫，豬肉中囊包里的幼蟲在－15℃需儲存20d才死亡，在腐肉中也能存活2～3個月。晾干、腌制、烤及涮食等方法常不能殺死幼蟲，但幼蟲在70℃時大多可被殺死。因此生食或半生食受感染的豬肉是人群感染旋毛蟲的主要方式，占發(fā)病人數(shù)的90％以上。在我國的一些地區(qū)，居民有食“殺片”“生皮”“剁生”的習(xí)俗，極易引起旋毛蟲病的暴發(fā)流行。曾報道，吉林有因吃涼拌犬肉、哈爾濱有因吃涮羊肉而引起人群感染旋毛蟲。此外，切生肉的刀或砧板因污染了旋毛蟲囊包，也可能成為傳播因素。

3 危害

人感染旋毛蟲后，潛伏2～26d開始發(fā)病，病初常有頭痛、惡心、嘔吐、腹痛腹瀉、畏寒發(fā)熱等癥狀。數(shù)日后可見眼瞼、面部、腹部及四肢水腫；水腫的同時全身肌肉疼痛。還可見皮疹、全身乏力、心悸、心律不齊，呼吸困難、流汗、咳嗽等癥狀。大部分病例可在感染后不久出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞增多。病理變化：脫囊幼蟲和成蟲侵入腸黏膜，引起廣泛的十二指腸炎、空腸炎癥。局部可出現(xiàn)充血、出血、水腫甚至淺表潰瘍。幼蟲在體內(nèi)移行時可引起小動脈和毛細(xì)血管的急性炎癥和水腫。幼蟲侵入橫紋肌后，肌纖維發(fā)生嗜堿性變性及肌漿溶解等變化。幼蟲周圍可出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，并有上皮樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及多核巨細(xì)胞圍繞，形成小卵圓形肉芽腫。如幼蟲寄生部位的肌膜破壞較輕，則形成初期的薄壁囊包，隨著時間的推移，其囊壁逐漸增厚形成厚壁囊包。

感染旋毛蟲后，豬、山羊及大鼠的組織病理變化基本類似。豬旋毛蟲病灶分為肉芽腫型、包囊型及混合型。肉聯(lián)廠豬旋毛蟲檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的大包囊病灶實(shí)際上分為兩種類型：肉芽腫型及既有包囊結(jié)構(gòu)又兼有肉芽腫變化的混合型。

（近年來與旋毛蟲相關(guān)的食品安全事件時有發(fā)生。2010年11月11日，阿根廷的科爾多瓦Cordoba）市報道了7個旋毛蟲病例。傳染源被認(rèn)為是用未經(jīng)檢疫的肉品生產(chǎn)的風(fēng)干臘腸。2005年6月2日，河南省鄭州市一所中學(xué)的高三學(xué)生吃了涮豬肉后，出現(xiàn)發(fā)熱、流鼻涕癥狀。家長以為孩子得了感冒，吃藥后，病情不但未見好轉(zhuǎn)，1周后又出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛，伴有眼瞼浮腫。醫(yī)生詳細(xì)詢問病史，并做了相關(guān)檢查，查出孩子患了旋毛蟲病。

2009年2月18日，云南省蘭坪縣不明疾病為食源性旋毛蟲病群體暴發(fā)。經(jīng)調(diào)查，發(fā)病農(nóng)民工吃飯的食堂衛(wèi)生條件較差，所食用的豬肉在加工過程中，砧板生熟混用，食用蔬菜經(jīng)常出現(xiàn)半生半熟的情況。

國外一些發(fā)達(dá)國家豬和人的旋毛蟲感染率很低。歐洲一些國家，豬與人的旋毛蟲感染很普遍，如人體旋毛蟲病為波蘭的一個嚴(yán)重醫(yī)學(xué)問題。實(shí)際上我國人體旋毛蟲感染情況遠(yuǎn)比報道得嚴(yán)重，因?yàn)樵谀承┑貐^(qū)旋毛蟲病還沒有引起有關(guān)方面重視、感染強(qiáng)度低時無典型臨床癥狀及醫(yī)生缺乏經(jīng)驗(yàn)，往往被誤診。

4 國內(nèi)外衛(wèi)生要求

歐盟2004/854/EC法規(guī)于2004年4月29日規(guī)定了對適于人類消費(fèi)的動物源性產(chǎn)品官方控制組織的特定規(guī)則（第18條），確保每一個動物胴體都接受了宰后檢驗(yàn)、企業(yè)按照歐盟要求進(jìn)行了微生物檢測、官方按照歐盟要求進(jìn)行了旋毛蟲檢測、肉品加貼了正確的衛(wèi)生標(biāo)志。官方肉品檢驗(yàn)員主要負(fù)責(zé)動物宰后檢驗(yàn)，并按照國家殘留監(jiān)控計劃進(jìn)行樣品取樣，對出口的豬肉簽發(fā)獸醫(yī)衛(wèi)生證書。

英國豬肉企業(yè)都建立并實(shí)施了HACCP法規(guī)，基本都按853/2004規(guī)章要求進(jìn)行生產(chǎn)與衛(wèi)生管理，確保動物健康與動物福利，官方部門按854/2004號規(guī)章進(jìn)行衛(wèi)生控制，按2075/2005號規(guī)章對肉中旋毛蟲進(jìn)行官方監(jiān)控。

5 檢測方法

5.1 病原學(xué)方法

寄生蟲直接檢查一般專指宰后胴體檢查，但宰前活體檢查法已有人報道過。直接檢察法的敏感性與被檢的組織量和采集組織的位置有關(guān)。通常采用的方法是旋毛蟲鏡檢技術(shù)，其敏感性為每克組織3個蚴蟲，而混合樣品消化法的敏感性為每克組織1個蚴蟲。直接檢察法能直接鑒定出感染后17d的豬，這與肌肉內(nèi)的包囊蚴已對新宿主具有侵染力的時間是一致的，只要包裹蚴是活的，那么直接檢察法就長期有效。在有大量組織（100g）可供消化情況下，本法的敏感性就大為提高。直接檢查法，特別是旋毛蟲檢查法的缺點(diǎn)是耗時、費(fèi)力、開支大。肌肉活組織檢查感染后第4周取三角肌或腓腸?。ɑ蚋∧[、肌痛最顯著的部位）近肌腱處肌肉一小塊，置兩塊玻片中壓緊，低倍鏡下觀察，可見卷曲的幼蟲，蟲體周圍有多數(shù)炎性細(xì)胞包繞，形成小型肉芽腫。感染較輕鏡檢陰性者，可將肌片用胃蛋白酶和稀鹽酸消化，離心沉淀后檢查幼蟲，其陽性率較壓片法為高。旋毛蟲病的直接檢察常用的是下面兩種方法：

5.1.1 旋毛蟲鏡檢或組織壓片法

取膈肌作為檢查樣品，將其切成至少28塊，每塊大小約為2mm×10mm。也可以取其他部位的樣品，如舌、咬肌及腹肌。但為了做敏感性比較，應(yīng)采用較大的樣品。將組織塊放在兩塊玻片之間，用力擠壓成半透明狀。然后，通過一臺特別的投射顯微鏡即旋毛蟲鏡或者一臺15～40倍的常規(guī)顯微鏡做蟲體檢查。在單個肌細(xì)胞上可見卷縮的幼蟲。由于幼蟲有囊，肌細(xì)胞的形狀為卵圓形。在嚴(yán)重感染時在單個肌細(xì)胞上可見多個幼蟲。這種方法很難測出在肌細(xì)胞中不存在的擬氣門旋毛蟲幼蟲。

5.1.2 消化法

肌肉組織可用消化液消化，這樣能使肌囊釋放出活的旋毛蟲。這里介紹的是歐盟（Eu）內(nèi)部常用的四種消化方式：①人工消化單個樣品或混合樣品；②機(jī)械混合樣品消化沉降技術(shù)；③用濾器分離技術(shù)的機(jī)械性混合樣品消化法；④混合樣品磁力攪拌法。具體操作如下：

（1）采樣 一般從動物的膈肌處或舌部取肌樣，馬從舌肌或咬肌處取樣。其他部位的器官組織存在包囊蚴數(shù)目一般較少。樣品塊大小可以不同，但從一頭豬豬體上采取100g樣品，或從許多頭豬豬體上采取許多樣品，混在一起為100g。樣品的大小將決定后一種方法的敏感性。歐盟要求在檢查豬胴體時每100g產(chǎn)品中取1g樣品，檢查馬肉時每100g產(chǎn)品中取5g樣品。在美國，豬要求取5g樣品。實(shí)際操作中，樣品最小5g，即100g混合樣品中含20個動物的樣品，樣品磨碎或切碎以便消化。

（2）消化和回收 每100g組織樣品用1L人工胃液，內(nèi)含1％（w/v）胃蛋白酶（1/10000中國藥典）和1％（V/V）的鹽酸（0.12N終濃度）消化。將磨好或切好的組織樣品加入已預(yù)熱至37℃的消化液內(nèi)，然后放到磁力攪拌器上，在37℃攪動3h，或在較高溫度下可縮短攪動時間（如44～46℃30～60min）。靜置15～20min讓消化物澄清，將上部2/3的液體傾去，將余下的液體和沉渣再通過網(wǎng)眼直徑為355μm的玻璃漏斗篩濾后，靜置15～20min。將上部上清液盡可能吸去，但不要泛起沉渣。沉淀用溫?zé)幔?7℃）的自來水沖洗，再靜置15～20min。反復(fù)沖洗直至上清液透亮。將洗過的沉淀物移入50mL的試管內(nèi)，讓其靜置，吸取最下面的10mL沉淀。為了計數(shù)，則把所有的10mL沉淀倒進(jìn)一個有適當(dāng)坐標(biāo)方格的培養(yǎng)平皿內(nèi)，并用解剖顯微鏡（15～40倍）檢查旋毛蟲幼蟲。一期幼蟲被消化后脫離肌細(xì)胞，大小約1mm長、0.03mm寬。旋毛蟲幼蟲的主要特征是食管部含有圓盤形的一系列細(xì)胞，這一部分占身體的半數(shù)以上。旋毛蟲幼蟲天冷時呈卷曲狀，熱時運(yùn)動，若死亡則呈C形。若有可疑則應(yīng)用高倍鏡或取更多的組織檢查。如果數(shù)目較大，則應(yīng)做適當(dāng)稀釋。在混合樣品消化物中檢出包囊蚴時，則必須用組成混合樣品的單個樣品重復(fù)上述檢查。

使用一臺有恒溫控制裝置的組織攪拌器可將消化時間縮短到12～15min，使用3500T型實(shí)驗(yàn)室攪拌器的其他處理混合樣品的方法已做過報道。歐洲經(jīng)濟(jì)共同體（84/319EEC）也推薦使用磁力攪拌器處理樣品。

5.2 免疫學(xué)方法

5.2.1 血清學(xué)檢測

血清學(xué)檢測在抗體檢測上取得良好效果，用于檢驗(yàn)寄生蟲特異性抗體的ELISA為動物屠宰前后的血清血液檢驗(yàn)提供了一種快速的方法。它能檢測到100g組織中只有一個包囊蚴的低水平感染。感染豬和馬已研制成功幾種高度特異性的抗原制品。它們對豬旋毛蟲病的診斷具有高度的特異性。經(jīng)屠宰檢查對照，ELISA假陽性率＜0.3％，但對每克組織感染1個以上蚴蟲的豬敏感。由于旋毛蟲所有型蟲種都含有旋毛蟲分泌性抗原（ES），所以在ELISA中采用分泌性抗原來檢測旋毛蟲的存在。其他非ELISA的血清學(xué)方法（如間接免疫熒光試驗(yàn)）缺乏特異性，不適用于檢測旋毛蟲感染。

豬旋毛蟲病血清學(xué)診斷的缺點(diǎn)是，人、畜感染旋毛蟲后，抗體持久存在于血清中，不利于療效考核。感染豬群出現(xiàn)小部分的假陰性結(jié)果。這樣的結(jié)果是輕度、中等程度感染的豬體內(nèi)的抗體應(yīng)答的動力學(xué)起動慢的緣故。這種慢速度的抗體形成意味著感染后幾周內(nèi)不能做出診斷。感染后豬的血清學(xué)反應(yīng)至少持續(xù)6個月不下降。馬的抗體水平僅能維持幾個月。這與幼蟲在肌肉中的下降相一致。所以馬的血清學(xué)檢查方法價值有限。對于野生捕獵動物中的抗體反應(yīng)所知有限。血清學(xué)試驗(yàn)與消化試驗(yàn)比較，其優(yōu)點(diǎn)是在檢查輕度感染旋毛蟲的動物時敏感性提高；這種敏感性對檢查農(nóng)場是否存在持續(xù)感染非常有用。而取樣為1g的消化試驗(yàn)，只能檢查比每克中有3個幼蟲更嚴(yán)重的后果，有些動物盡管感染更嚴(yán)重，但在感染后21～35d血清仍可呈陽性。因此血清學(xué)檢測在監(jiān)測計劃中是很有價值的，在屠宰檢查時可替代消化試驗(yàn)。由于旋毛蟲感染通常少見，隨機(jī)取樣并不可靠，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行群體檢驗(yàn)，這就需要制定整體監(jiān)測方案。

其中，近年國內(nèi)外已成功地制備出旋毛蟲幼蟲單克隆抗體。采用蟲體可溶性抗原（有感染性幼蟲體可溶性粗抗原和自感染性幼蟲體桿細(xì)胞內(nèi)α顆粒提取的可溶性抗原兩種）、表面抗原（自蟲體表面提取或剝離的可溶性抗原）及排泄分泌性抗原（或稱代謝抗原排泄分泌性抗原）結(jié)合單克隆抗體、多克隆抗體-間接雙抗體夾心ELISA法檢測患者血清中循環(huán)抗原，抗原陽性結(jié)果提示為現(xiàn)癥感染，且具療效考核價值。

國內(nèi)外試用過多種免疫學(xué)方法，包括皮內(nèi)試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、皂土絮狀試驗(yàn)、對流免疫電泳、環(huán)蚴沉淀試驗(yàn)、間接熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）、間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（IHAT）以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。其中后四者的特異性強(qiáng)、敏感性高，且可用于早期診斷。

5.2.1.1 IFAT

IFAT較早用于診斷旋毛蟲病，初期用全蟲做抗原，后來發(fā)展為用蟲體或帶蟲肌肉切片做抗原。以全幼蟲做抗原，在幼蟲皮層周圍或幼蟲口部有熒光沉淀物者為陽性反應(yīng)。患者于感染后2～7周可出現(xiàn)陽性反應(yīng)。應(yīng)用旋毛蟲幼蟲冰凍切片做抗原，以IFAT檢測旋毛蟲病人血清，抗體陽性率為90.74％，發(fā)病后第1周抗體陽性率70.59％，第2周升至91.30％，有顯著差異（P＜0.025），至第3、4周分別達(dá)95.83％和100％。旋毛蟲幼蟲抗原片在－20℃至少可保存25年而不失活。對旋毛蟲早期和輕度感染均有診斷價值。

5.2.1.2 IHAT

IHAT用凍干致敏綿羊紅細(xì)胞，以IHAT檢測患旋毛蟲病人血清中抗體。用濾紙干血滴代替血清，結(jié)果無顯著差異，用IHAT方法檢測感染旋毛蟲豚鼠血清，陽性率為100％。結(jié)果表明操作簡便的IHAT具有較高的敏感性和特異性，適用于流行病學(xué)調(diào)查。

5.2.1.3 ELISA

ELISA敏感性高于IFAT。常以蟲體生理鹽水浸出液為抗原。ELISA由于具有經(jīng)濟(jì)、檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化、特異性和敏感性比較穩(wěn)定以及檢測結(jié)果可信度高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為人及動物旋毛蟲病最常用的檢測方法，同時它也是OIE唯一推薦使用的、用于家豬旋毛蟲感染的血清學(xué)檢測方法。

用ELISA診斷旋毛蟲病時，使用的抗原為旋毛蟲的分泌性抗原。這種分泌性抗原是由分子量為45～55ku的糖蛋白組成的。

（1）抗原制備 試驗(yàn)中所用抗原的質(zhì)量決定ELISA的特異性和敏感性。用L1（1期）幼蟲制備的特異性抗原帶有TSL-1抗原表位，可被旋毛蟲抗原所識別。該抗原可用來檢測感染旋毛蟲的動物，因所有旋毛蟲均有此類抗原。該旋毛蟲抗原制備采用旋毛蟲（Tspiralis），由國際旋毛蟲保種中心（在意大利羅馬）命名為T1。該旋毛蟲作為重要診斷抗原在鼠體內(nèi)需要經(jīng)過一系列的發(fā)育階段。

制備ELISA抗原，將去掉皮和內(nèi)臟并已磨碎的旋毛蟲（T1），感染鼠胴體，用1％胃蛋白酶和1％鹽酸消化3h（37℃）后回收旋毛蟲的肌肉期幼蟲。幼蟲用含有500U雙抗的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基（DMEM，含青鏈霉素各500U/mL）浸洗3次，每次20min，并放在DMEM完全培養(yǎng)基中（即DMEM中補(bǔ)加下列成分：HPES10mmol/L，谷氨酰胺2mmol/L，丙酮酸1mmol/L和各50U的雙抗）。并在10％二氧化碳的環(huán)境下置37℃培養(yǎng)18～20h?；厥盏呐囵B(yǎng)物濾去蟲體，濾液在3ku分子量的滯留壓力下濃縮。回收的分泌性抗原約含25種蛋白質(zhì)成分，大部分蛋白質(zhì)都含有旋毛蟲肌幼蟲糖抗原表位（TSL-1）。

抗原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與ELISA的特異性具有至關(guān)重要的關(guān)系。應(yīng)通過顯微鏡分階段觀察或通過樣品的平板檢測細(xì)菌生長情況。對于有細(xì)菌生長的平板應(yīng)予廢棄。幼蟲最長保存時間為20h，超過此時限會由于菌體抗原滲出蟲體遭到破壞而降低特異性。用來做鑒定的抗原在波長280/260mm處的吸光度值應(yīng)大于10。體外培養(yǎng)獲得的旋毛蟲幼蟲的抗原應(yīng)通過已知陰性、陽性血清反應(yīng)測定。

（2）試驗(yàn)程序

①用包被緩沖液（50mmol/L碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液，）將旋毛蟲分泌性抗原稀釋至5μg/mL，每孔加入100μL抗原稀釋液包被96孔微量滴定板。37℃放置60min或4℃過夜。

②用洗液[含50mmol/L Tris，，150mmol/L氯化鈉，5.0％脫脂干乳和1.0％聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-100）]將板沖洗3次。每次洗滌后，將滴定板晾干。

③用洗液1∶10或1∶100稀釋豬血清。另外還可用全血和組織液替代血清。加100μL稀釋的豬血清到抗原包被孔。每板設(shè)與試驗(yàn)血清相同稀釋度的已知陽性和陰性血清做對照。室溫下孵育30min。

④按②洗滌3次。

⑤用洗液將兔抗豬IgG過氯化物酶結(jié)合物做（0.1mg/mL）1∶1000稀釋，每孔加入100μL。室溫下孵育30min。

⑥按②洗滌3次；最后1次用蒸餾水沖洗。

⑦加入100μL適當(dāng)?shù)倪^氧化物酶底物[如5′-對氨基水楊酸（08mg/mL）含0.005％過氧化氫酶解底物，～6.0]。

⑧5～15min后，在酶標(biāo)儀上以450nm波長測定微量板的OD值，當(dāng)該值達(dá)到混合陰性對照血清值的4倍判為陽性，達(dá)3倍則判為可疑。阻斷值受豬品種影響。

商業(yè)用的ELISA是雙抗體夾心ELISA法，它使用過氧化物酶標(biāo)記的抗豬血清，測定時間短，所需時間不應(yīng)超過1h。

5.2.1.4 免疫膠體金技術(shù)

采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金，將膠體金標(biāo)記ES重組抗原溶液用X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃棉上，將單克隆抗體及羊抗豬LgG分別點(diǎn)射于印膜上形成陽性與陰性兩條線，檢測時取被檢豬的肌肉組織1∶5或1∶20倍稀釋勻漿或剪碎，試紙條測試端浸入勻漿組織液（或1∶5或1∶20倍稀釋的被檢豬血清）10s或20s后取出平放，在5min內(nèi)判定檢測結(jié)果，出現(xiàn)1條反應(yīng)線即陽性線和對照線時判為陽性，只出現(xiàn)1條對照線時判為陰性。檢測過程中如無對照線出現(xiàn)時判試紙條失效。

5.3 PCR

PCR是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來的一種在體外迅速大量擴(kuò)增特異性DNA的新技術(shù)，它具有高度的靈敏性和特異性。目前，Caballero等用PCR對試驗(yàn)感染小鼠進(jìn)行旋毛蟲病早期診斷，結(jié)果最早在感染后第3天檢測到旋毛蟲DNA，在第3～17天，33只試驗(yàn)鼠血樣中均檢測到旋毛蟲DNA。根據(jù)旋毛蟲幼蟲1.6kb基因序列而設(shè)計合成引物，以PCR檢測含鼠旋毛蟲幼蟲及純幼蟲。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見擴(kuò)增出了特異的670bp與500bp大小的DNA帶，而正常肌肉對照未見擴(kuò)增出此帶。本法可檢測0.01條幼蟲產(chǎn)物，具有高敏感性和特異性。但由于旋毛蟲本身及其在宿主體內(nèi)寄生部位的特殊性，難以在生前從被感染動物的血清、組織液中擴(kuò)增到旋毛蟲DNA，故利用PCR基因檢測技術(shù)對旋毛蟲病生前檢測受到限制。