董京政、衡立、康師傅吳三、劉健、錢志宗、張建國(guó)、張金存、李一國(guó)、沈紅、趙鳳紅?？剐郧傲邢侔撛诤诵幕虻纳镄畔W(xué)分析中國(guó)全科醫(yī)學(xué)[J]，2022，25(

東京町、恒利、康韶山、柳堅(jiān)、天智沖、張力國(guó)、張錦村、李志國(guó)、沈宏沖

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是癌癥相關(guān)死亡率第二大惡性疾病[1]，目前主要用雄激素剝奪療法(ADT)治療[2]

據(jù)報(bào)道，10%~20%的PCa患者對(duì)ADT產(chǎn)生抵抗，最終演變?yōu)槿?shì)抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），且中位生存期僅為14個(gè)月[3]，預(yù)后不良，死亡率極高[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)在去勢(shì)狀態(tài)下雄激素受體（androgen receptor，AR）信號(hào)的傳導(dǎo)與CRPC潛在分子機(jī)制有關(guān)[5]，但具體機(jī)制仍不十分清楚，且目前臨床上尚無(wú)有效治療CRPC的方法。因此亟須尋找新的關(guān)鍵基因，為臨床診療提供新思路。

生物信息學(xué)是一門分析理解生物數(shù)據(jù)的學(xué)科，其可以在生物體表達(dá)的不同位置、不同通路中進(jìn)行富集，從而發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)聯(lián)的生物信息，還可根據(jù)基因本體論（GO）、京都基因和基因組百科全書（KEGG）和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）綜合分析，獲取在癌癥相關(guān)疾病中較為穩(wěn)定的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），是一種能有效發(fā)掘癌癥相關(guān)疾病基因表達(dá)譜的重要工具[6]。已有研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法找到與PCa相關(guān)的關(guān)鍵基因。SUN等[7]通過(guò)生物信息學(xué)分析鑒定出ARHGEF38等關(guān)鍵基因和PCa進(jìn)展相關(guān)；SHEN等[8]運(yùn)用基因表達(dá)分析揭示了與PCa預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因并提出靶向細(xì)胞周期通路可能與PCa的預(yù)后和治療相關(guān)；GU等[9]采用生物信息學(xué)方法確定了TOP2A、CCNB2等關(guān)鍵基因可促進(jìn)PCa的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步找到和CRPC發(fā)展密切的候選基因，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法挖掘與CRPC進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵基因。

本研究結(jié)合CRPC和PCa樣本的基因表達(dá)譜，首先對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理，篩選DEGs，分析DEGs的功能和途徑以及疾病的信號(hào)通路。然后構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，對(duì)重要模塊進(jìn)行分析并篩選出具有生存意義的關(guān)鍵基因，本研究結(jié)果可為CRPC發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)后的相關(guān)研究提供新思路。

1　資料與方法

1.1　數(shù)據(jù)收集

從國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）（）的GEO（geo/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載微陣列數(shù)據(jù)集GSE32269。GSE32269芯片由Affymetrix公司GPL96平臺(tái)檢測(cè)，包括29例CRPC樣本和22例原發(fā)性PCa樣本。

1.2　篩選DEGs

使用R語(yǔ)言4.0.3中的Affy包[10]，將normalize.method設(shè)置為"quantiles"，bgcorrect.method設(shè)置為"rma"，設(shè)置為"pmonly"，設(shè)置為"liwong"，提取基因的表達(dá)量。然后采用t檢驗(yàn)得到兩組樣本基因表達(dá)量的P值，利用Benjamini-Hochberg錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率方法，調(diào)整P值來(lái)降低假陽(yáng)性率[11]。采用校正后P<0.05，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）>1.5作為截?cái)嘀档臉?biāo)準(zhǔn)，篩選CRPC和原發(fā)性PCa樣本之間的DEGs。

1.3　功能富集分析

利用DAVID在線工具（）對(duì)DEGs進(jìn)行GO富集和KEGG信號(hào)通路分析[12]。GO是一種生物信息學(xué)工具，可以提供關(guān)于分子功能（MF）、細(xì)胞成分（CC）和生物過(guò)程（BP）等生物領(lǐng)域的信息[13]。KEGG是與系統(tǒng)集成基因功能信息相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)[14]。富集顯著性閾值設(shè)為P<0.05。利用R軟件中的GOplot包使GO富集結(jié)果可視化。為了確定CRPC中通路的變化趨勢(shì)，使用以下公式計(jì)算每項(xiàng)的Z分?jǐn)?shù)：Z-score=（Nup-Ndown）/

，Nup和Ndown分別代表CRPC和原發(fā)性PCa對(duì)照之間上調(diào)和下調(diào)的基因數(shù)量，count是該術(shù)語(yǔ)DEGs的數(shù)量[15]。

1.4　PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊分析

為預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間物理和功能的相互作用，本研究使用STRING（）構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)（互作評(píng)分>0.4）[16]。采用Cytoscape 3.7.2版（）軟件進(jìn)行可視化處理[17]。利用MCODE插件[18]對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析，較高分?jǐn)?shù)的模塊在疾病的發(fā)展過(guò)程中具有重要意義。

1.5　鑒定關(guān)鍵基因

選擇滿足以下2個(gè)約束條件的DEGs作為關(guān)鍵基因：（1）該基因位于關(guān)鍵模塊中（模塊分?jǐn)?shù)>40）；（2）使用Cytoscape軟件計(jì)算，同時(shí)符合最大鄰域分量（maximum neighborhood component，MNC）、最大鄰域分量密度（density of maximum neighborhood component，DMNC）和最大集團(tuán)中心性（maximal clique centrality，MCC）前30位的基因。

1.6　關(guān)鍵基因的生存分析和受試者工作特征（ROC）曲線分析

癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（）數(shù)據(jù)庫(kù)擁有龐大的PCa樣本量，能提供大量的臨床信息[19]?；赥CGA并在基因表達(dá)和生存分析的交互式網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2，GEPIA2）（）下，對(duì)這些關(guān)鍵基因采用Mantel-Cox檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析[20]，評(píng)價(jià)患者預(yù)后，其中總生存期是指從隨機(jī)化分組開始至因任何原因引起死亡的時(shí)間；無(wú)病生存期是指從隨機(jī)化分組開始至疾病復(fù)發(fā)或由于疾病進(jìn)展導(dǎo)致患者死亡的時(shí)間。然后繪制關(guān)鍵基因的ROC曲線，用R軟件pROC包[21]計(jì)算ROC曲線下面積（AUC），可以直觀地分析關(guān)鍵基因?qū)RPC的診斷價(jià)值，一般認(rèn)為AUC>0.50，越接近于1則診斷價(jià)值越高[22]。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　CRPC的DEGs篩選

通過(guò)對(duì)微陣列數(shù)據(jù)集GSE32269分析共篩選出279個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因175個(gè)，下調(diào)基因104個(gè)（圖1，彩圖掃描文章首頁(yè)二維碼）。

Figure 1

Figure 1 Identification of differentially expressed genes in castration-resistant prostate cancer

2.2　CRPC的DEGs GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析

GO富集分析結(jié)果顯示，CRPC的DEGs主要參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞分裂、有絲分裂姐妹染色單體分離、有絲分裂核分裂和有絲分裂胞質(zhì)分裂等BP（圖2A、表1），主要分布在細(xì)胞外外泌體、細(xì)胞外基質(zhì)等CC（圖2B、表2），主要有細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、蛋白質(zhì)結(jié)合等MF（圖2C、表3）。KEGG結(jié)果顯示，CRPC的DEGs主要參與黏著斑、PI3K-Akt信號(hào)通路和細(xì)胞周期等途徑（圖3）。

Table 1 Major biological processes in which differentially expressed genes in castration-resistant prostate cancer being involved

Table 2 Major cellular components of differentially expressed genes involved in castration-resistant prostate cancer development

Table 3 Major molecular functions of differentially expressed genes involved in castration-resistant prostate cancer development

Figure 2

Figure 2 GO enrichment results of differentially expressed genes in castration-resistant prostate cancer

Figure 3

Figure 3 KEGG enrichment results of differentially expressed genes involved in castration-resistant prostate cancer development

2.3　CRPC的DEGs PPI分析及關(guān)鍵基因篩選

應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的279個(gè)DEGs進(jìn)行PPI分析，通過(guò)移除分離和單獨(dú)連接的節(jié)點(diǎn)，應(yīng)用Cytoscape將蛋白網(wǎng)絡(luò)可視化，得到一個(gè)由224個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 665條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4A）。使用MCODE識(shí)別出了最重要的模塊（分?jǐn)?shù)=42.093），由43個(gè)節(jié)點(diǎn)和863條邊組成（圖4B）。根據(jù)篩選條件共鑒定出15個(gè)關(guān)鍵基因（圖4C），分別是CDC20、CCNB2、PRC1、MAD2L1、PBK、NUSAP1、RRM2、SMC2、MELK、KIF4A、DTL、ZWINT、CEP55、RACGAP1和CDKN3（表4）。

Table 4 Details of key genes of differentially expressed genes involved in castration-resistant prostate cancer development

Figure 4

Figure 4 PPI network and key genes involved in castration-resistant prostate cancer development

2.4　關(guān)鍵基因與CRPC患者預(yù)后的關(guān)系

對(duì)15個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，CDC20（n=245）、MAD2L1（n=246）和NUSAP1（n=246）高表達(dá)組CRPC總生存期分別短于CDC20（n=245）、MAD2L1（n=246）和NUSAP1（n=246）低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049，P=0.035，P=0.020），見(jiàn)圖5。CDC20、MAD2L1和NUSAP1高表達(dá)組CRPC無(wú)病生存期分別短于CDC20、MAD2L1和NUSAP1低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=7.5E-05，P=0.043，P=0.002），見(jiàn)圖6。繪制CDC20、MAD2L1和NUSAP1預(yù)測(cè)CRPC發(fā)生的ROC曲線，結(jié)果顯示，AUC分別為0.933、0.762、0.950（圖7）。

Figure 5

Figure 5 Overall survival curves between castration-resistant prostate cancer patients with highly and low expressed CDC20，MAD2L1 and NUSAP1

Figure 6

Figure 6 Disease-free survival curves between castration-resistant prostate cancer patients with highly and low expressed CDC20，MAD2L1 and NUSAP1

Figure 7

Figure 7 ROC curves of CDC20，MAD2L1 and NUSAP1 predicting castration-resistant prostate cancer

3　討論

CRPC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，AR擴(kuò)增、AR突變及AR變異等多種機(jī)制均參與CRPC的發(fā)生、發(fā)展[23]，但具體機(jī)制仍難以明確。本研究采用生物信息學(xué)方法分析芯片數(shù)據(jù)集共篩選出279個(gè)DEGs，通過(guò)GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集于細(xì)胞分裂、有絲分裂和細(xì)胞周期。已有研究表明，有絲分裂停滯可抑制CRPC的進(jìn)展[24]。CRPC的發(fā)生、發(fā)展和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期的基因密切相關(guān)[25,26,27]，提示細(xì)胞分裂、有絲分裂和細(xì)胞周期是影響CRPC發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

本研究在這些DEGs中鑒定出可能參與CRPC發(fā)生和進(jìn)展的15個(gè)關(guān)鍵基因，對(duì)其進(jìn)一步驗(yàn)證時(shí)發(fā)現(xiàn)，CDC20、MAD2L1和NUSAP1的高表達(dá)均與CRPC總生存期及無(wú)病生存期呈負(fù)相關(guān)，且AUC均>0.50，表明CDC20、MAD2L1和NUSAP1的表達(dá)能影響CRPC的預(yù)后，且對(duì)CRPC有較高的診斷價(jià)值。

CDC20不僅是一種關(guān)鍵的E3連接酶，還是一種細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑，可與腺瘤性息肉病大腸埃希菌（APC）結(jié)合，識(shí)別D-box或KEN盒底物以促進(jìn)蛋白酶體的降解。CDC20與APC結(jié)合后，可通過(guò)破壞關(guān)鍵的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在有絲分裂的中期到后期發(fā)揮致癌功能[28]。已有研究報(bào)道，上調(diào)的CDC20在包括胰腺導(dǎo)管腺癌、乳腺癌、白血病、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和胃癌[29,30,31]等多種惡性腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，并與這些癌癥的不良預(yù)后相關(guān)。DAI等[32]通過(guò)遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CDC20可增強(qiáng)PCa細(xì)胞的遷移能力。ZHANG等[33]證明CDC20可通過(guò)腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞中的β-連環(huán)蛋白來(lái)驅(qū)動(dòng)PCa發(fā)生，其表達(dá)下降可抑制CD44+ PCa干細(xì)胞的表達(dá)，且與PCa患者的不良預(yù)后相關(guān)。有研究證明，敲低CDC20可抑制轉(zhuǎn)移性CRPC的發(fā)生并增強(qiáng)CRPC對(duì)多西他賽的敏感性，而CDC20的過(guò)表達(dá)則可通過(guò)依賴Bim的方式促進(jìn)CRPC細(xì)胞系對(duì)多西紫杉醇耐藥[34]。

MAD2L1是有絲分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)的一個(gè)組成部分，阻止有絲分裂后期發(fā)生，直到所有染色體在中期排列正確。已有研究表明，MAD2L1可促進(jìn)人前列腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)[35]，其過(guò)表達(dá)與小細(xì)胞肺癌侵襲性和轉(zhuǎn)移有關(guān)，并可通過(guò)被MiR-200c-5p抑制而降低人肝細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移[36,37]。MAD2L1和CDC20之間可以相互作用，在調(diào)節(jié)有絲分裂中共同發(fā)揮重要功能[35]。CHOI等[38]發(fā)現(xiàn)CDC20和MAD2L1共同高表達(dá)能促進(jìn)尿路上皮膀胱癌的不良預(yù)后，表明CDC20和MAD2L1在癌癥相關(guān)疾病中可以相互影響，共同發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，CDC20和MAD2L1的高表達(dá)均與CRPC的不良預(yù)后相關(guān)，提示CDC20和MAD2L1可能是影響CRPC發(fā)生和預(yù)后的潛在基因。

NUSAP1在紡錘體微管組織中起作用，是一種核仁-紡錘體相關(guān)蛋白。NUSAP1在細(xì)胞增殖中特異性表達(dá)，并在細(xì)胞周期和細(xì)胞質(zhì)分裂中起至關(guān)重要的作用[39]。已有研究證實(shí)NUSAP1是PCa進(jìn)展的生物標(biāo)志物之一，可通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)PCa的侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移，從而推動(dòng)PCa的進(jìn)展[40,41]。GORDON等[42]發(fā)現(xiàn)，使用慢病毒敲低NUSAP1減少了DU145或PC-3-RB1細(xì)胞的增殖和侵襲，表明NUSAP1可影響PCa細(xì)胞增殖和侵襲。據(jù)報(bào)道，NUSAP1在多種癌癥中過(guò)度表達(dá)且NUSAP1的表達(dá)升高與這些癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)，包括乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌等[43,44,45,46,47,48,49]。本研究結(jié)果提示，NUSAP1的高表達(dá)與CRPC的總生存期及無(wú)病生存期呈負(fù)相關(guān)，對(duì)CRPC有較好的診斷價(jià)值。以上研究結(jié)果表明，NUSAP1可能是影響CRPC早期診斷和預(yù)后的潛在因子。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)CRPC及原發(fā)性PCa組織樣本的DEGs分析，鑒定出3個(gè)關(guān)鍵基因：CDC20、MAD2L1和NUSAP1，這3個(gè)關(guān)鍵基因與CRPC疾病的診斷和預(yù)后密切相關(guān)，為CRPC疾病進(jìn)展的分子機(jī)制研究及預(yù)后判斷提供了新靶點(diǎn)。但由于缺乏實(shí)驗(yàn)分析，其具體機(jī)制目前尚不十分明確，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本文無(wú)利益沖突。

本文表格略。

參考文獻(xiàn)略。