寫作：波波老師

資料來源：干細(xì)胞者說

外分泌體無疑是這幾年的熱點(diǎn)，無論是基礎(chǔ)研究還是技術(shù)開發(fā)都在指數(shù)上升。

在過去短短幾年里，外泌體賺足了眼球，也受到了資本的大力追捧，呈現(xiàn)出一派欣欣向榮的景象。關(guān)于外泌體，“干細(xì)胞者說”科普文章里中不只提到過一次，大家并不陌生。還是那句話，不管市場怎么吹捧，在知識層面，我們要有正確的認(rèn)識。

1 外泌體是人體的“順豐快遞”

2013年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予了三位科學(xué)家，表彰其在細(xì)胞間囊泡運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制領(lǐng)域作出的突出貢獻(xiàn)。諾獎的加持，使得外泌體及其生理學(xué)功能成為熱點(diǎn)，得到廣泛研究。

外泌體是一種直徑為30-150nm的細(xì)胞外囊泡，具有獨(dú)特的介導(dǎo)細(xì)胞間通信和相互作用。從制藥角度來看，外泌體是內(nèi)源性脂質(zhì)納米顆粒（LNP），由真核細(xì)胞產(chǎn)生，被雙層脂質(zhì)膜包裹。

一種理解外泌體的簡單方法，外泌體是人體的天然“順豐快遞”通道。作為細(xì)胞間的一種通訊方式，人體幾乎所有類型的細(xì)胞都能分泌外泌體，外泌體廣泛存在并分布于各種體液（例如血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中）中，攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和脂質(zhì)類物質(zhì)等。

外囊泡三劍客：凋亡小體、微泡、外泌體

細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）是機(jī)體遠(yuǎn)距離細(xì)胞間交流的一種手段。關(guān)于外囊泡來源和命名存在著很多混淆，叫啥的都有。目前主要被分為3大類：外泌體、微泡和凋亡小體。臨床研究中主要關(guān)注的是外泌體和微泡。其實(shí)這兩個(gè)也不好分。

外泌體的大小、形狀和類型也不盡相同。重要的是，它們有不同的表面特性和分子組成。它們的外膜包含不同的表面標(biāo)記物，其中，典型的是跨膜四蛋白CD9、CD63和CD81。

總結(jié)來說，外泌體的基本信息概括如下：

外泌體基本信息概括：

外泌體大?。褐睆郊s30-150nm

微囊泡大?。褐睆綖?00nm-1μm

從研究上來講，并不嚴(yán)格區(qū)分外泌體（exosomes）或微泡（microvesicles）。

外泌體數(shù)量：人體中大約有10*14個(gè)，平均每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生1000-10000個(gè)

外泌體來源：人體中幾乎所有類型的細(xì)胞均能產(chǎn)生外泌體

外泌體異質(zhì)性：即使是同一種細(xì)胞分泌的外泌體都有可能具有很大功能區(qū)別

外泌體存在：外泌體幾乎存在于所有的組織、細(xì)胞間隙、體液中。

2 外泌體有好的，也有壞的

外泌體研究領(lǐng)域發(fā)展迅速，但許多科學(xué)問題仍未得到解答。例如人體中大約每天產(chǎn)生10*14個(gè)外泌體，近乎于平均每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生1000-10000個(gè)。如何利用來自這么多形形色色的外泌體呢?

外泌體起源于細(xì)胞內(nèi)吞過程中形成的內(nèi)體，再從細(xì)胞中釋放到胞外。幾乎所有細(xì)胞都可以分泌外泌體。干細(xì)胞里有外泌體，可能具有抗炎和組織再生作用，這屬于好的外泌體。腫瘤細(xì)胞里也有外泌體，可能進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這就是壞的外泌體了。

干細(xì)胞外泌體

干細(xì)胞外泌體具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗纖維化、抑制氧化應(yīng)激、增強(qiáng)血管生成等作用。這主要依賴于其中的蛋白和核酸組分。例如間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）外泌體富含糖酵解相關(guān)酶，可增加ATP的產(chǎn)生，減少組織細(xì)胞死亡。MSCs外泌體還含有VEGF、TGF-β、IL-6、IL-10和HGF等細(xì)胞因子，有利于血管生成和免疫調(diào)節(jié)。

• 2018年5月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了Aegle公司的首個(gè)細(xì)胞外囊泡新藥臨床試驗(yàn)申請，以開始用于燒傷患者的臨床試驗(yàn)。通過分離純化MSCs分泌的細(xì)胞外囊泡，用以治療嚴(yán)重的皮膚病，包括燒傷和大皰性表皮松解癥。

• 2019年6月，United Therapeutics宣布其基于外泌體治療支氣管肺發(fā)育不良（BDP）的 I 期試驗(yàn)獲批開展。

• 2020年1月，Exopharm宣布了其在人類臨床試驗(yàn)中的首次給藥，成為首家測試外泌體對傷口愈合能力的公司。Exopharm的Plexaris產(chǎn)品，是無細(xì)胞的血小板外泌體制劑，在臨床前動物研究中，改善了傷口閉合，并減少了疤痕。

如何提高外泌體的分泌量。在外界刺激條件下，體外培養(yǎng)中的細(xì)胞會產(chǎn)生更多的外泌體，外泌體的內(nèi)容物也會發(fā)生變化。例如，缺氧、缺營養(yǎng)或其它應(yīng)激會產(chǎn)生具有不同的外泌體，可能會產(chǎn)生不同的“貨物”信息。培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間也會影響細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體的類型和功能。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）具有治療多種疾病的潛力，包括膝關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如帕金森病、中風(fēng)、阿爾茨海默病等）。實(shí)驗(yàn)室條件下，MSCs 可經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增。但每次擴(kuò)增干細(xì)胞外泌體的分泌數(shù)量是不同的；或許每次擴(kuò)增，分泌的外泌體類型也是不同的。

腫瘤細(xì)胞外泌體

多年來，腫瘤學(xué)家一直在尋找用于腫瘤早期檢測和癌癥復(fù)發(fā)監(jiān)測的生物標(biāo)志物。外泌體可以提供一種潛在的解決方案，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體與非腫瘤宿主細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體不同，在腫瘤生長和最終轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。問題的關(guān)鍵是在于找到特異性腫瘤外泌體，并弄清它們的內(nèi)容物。

腫瘤細(xì)胞的外泌體，含有大量與腫瘤相關(guān)的核酸和蛋白，在癌癥發(fā)生和早期檢測中具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。

外泌體內(nèi)容物作為腫瘤的潛在診斷標(biāo)志物

那么，問題來了。面對紛繁復(fù)雜的外泌體，如何鑒別來自不同細(xì)胞的外泌體和來自同一細(xì)胞的不同外泌體?

3 外泌體的復(fù)雜多變

隨著外泌體行業(yè)的快速發(fā)展，分離和鑒定外泌體亞群的工作變得越來越重要。外泌體亞群對基礎(chǔ)科研、診斷疾病和治療藥物的開發(fā)至關(guān)重要。

如果對外泌體進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)同一種細(xì)胞來源的會產(chǎn)生不同的外泌體。即使是同一種細(xì)胞的外泌體，純化后具有不同的形態(tài)。外泌體亞群有很多不同：大小、形狀、密度、膜表面受體、荷載以及細(xì)胞來源。

外泌體在尺寸、內(nèi)容物、功能和來源均有差異性

鑒定外泌體亞群的最好方法是表面標(biāo)記物，可以利用外泌體不同的表面標(biāo)記物進(jìn)行免疫捕獲，鑒定并分選出特定的外泌體亞群，以用于診斷或治療目的。

使用不同的細(xì)胞培養(yǎng)基，也會影響外泌體的內(nèi)容物和類型。此外，如果使用含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，可能原本就含有外泌體，這使收獲的外泌體分析更加復(fù)雜。不同的外泌體，即使來自同一細(xì)胞中，也會給產(chǎn)業(yè)化帶來無盡的困擾。

科學(xué)家們已經(jīng)認(rèn)識到外泌體研究的復(fù)雜性。然而，正是外泌體的這些復(fù)雜性，可以讓我們區(qū)分外泌體亞型、功能和“身份”，在癥狀出現(xiàn)之前，更早地識別疾病狀態(tài)，并促進(jìn)針對許多疾病的潛在治療。盡管外泌體擁有無限應(yīng)用前景，但也有很多挑戰(zhàn)，包括制備均一穩(wěn)定的外泌體產(chǎn)品，且制備方法可重復(fù)。

4 外泌體的成藥可能性

如今，眾多企業(yè)正在開發(fā)外泌體治療或診斷方法，針對純天然和工程化的外泌體產(chǎn)品進(jìn)行臨床試驗(yàn)。一點(diǎn)也毫不奇怪，許多細(xì)胞企業(yè)也在向外泌體領(lǐng)域拓展。迄今為止，全球約有40多家外泌體治療和診斷的公司（完整數(shù)據(jù)索取，請?jiān)u論處留下您的郵箱）。

基于外泌體治療的部分企業(yè)

基于外泌體診斷的部分企業(yè)

目前，許多基于外泌體的I/II期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。不同細(xì)胞來源的外泌體，在體內(nèi)顯示不同的歸巢能力，這可能是與其膜表面受體和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合蛋白有關(guān)。靜脈注射是基于外泌體遞送藥物中使用最為廣泛的給藥途徑。腹腔注射、瘤內(nèi)注射、口服和鼻腔噴霧給藥也在多種疾病動物模型中得到了嘗試。靜脈注射外泌體24h后，肝臟中熒光信號最強(qiáng)，其次是脾臟、胃腸道和肺部。因此，外泌體注射后的分布，以及長期的影響和安全性，仍將需要進(jìn)一步探索和闡明。

外泌體載藥可以分為三種：外源性載藥、內(nèi)源性載藥和轉(zhuǎn)基因。

• 外源性載藥方式：先分離外泌體，再將藥物通過轉(zhuǎn)染或電穿孔導(dǎo)入外泌體；

• 內(nèi)源性載藥方式：先將藥物導(dǎo)入細(xì)胞中，當(dāng)藥物進(jìn)入外泌體且從供體細(xì)胞中釋放后，分離純化得到載藥外泌體；

• 轉(zhuǎn)基因方式：通過轉(zhuǎn)基因的方式讓細(xì)胞自身表達(dá)，最終隨外泌體分泌至細(xì)胞外。

外泌體規(guī)?；瘧?yīng)用開發(fā)關(guān)鍵在于三點(diǎn)：一是依賴于細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)條件的提升。二是依賴于外泌體分離純化方法的提升。三是依賴于外泌體亞群的鑒定分離。

總結(jié)來說，外泌體在診斷和治療應(yīng)用方面的關(guān)鍵特征包括：

外泌體關(guān)鍵特征概括：

外泌體是納米大小、膜結(jié)合的囊泡。

外泌體在細(xì)胞通信和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著不可或缺的作用。

外泌體膜含有針對特定細(xì)胞類型的表面標(biāo)記物。

外泌體不是細(xì)胞，無免疫原性，且更穩(wěn)定，更易處理。

外泌體可能具有很大功能區(qū)別，即使是同一種細(xì)胞分泌。

外泌體的內(nèi)容物包含蛋白質(zhì)、RNA、DNA和脂類，易被鄰近或遠(yuǎn)處的細(xì)胞捕獲內(nèi)吞，并調(diào)節(jié)受體細(xì)胞。

外泌體藥物生產(chǎn)工業(yè)化（規(guī)模、純度、成本、一致性和標(biāo)準(zhǔn)化）是目前面臨的重大挑戰(zhàn)。相信未來幾年，從事外泌體產(chǎn)品開發(fā)的項(xiàng)目或企業(yè)將不斷增加，最終外泌體產(chǎn)品將走向商業(yè)化，造福患者。

聽說，美國FDA批準(zhǔn)Direct Biologics公司啟動一項(xiàng)I/II階段試驗(yàn)，以評估ExoFlo?治療新冠肺炎綜合癥。ExoFlo?產(chǎn)品是一種從人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (BM-MSCs) 中分離的cGMP級細(xì)胞外泌體。

外泌體，你可以嗎？

參考資料（部分）

1.Exosomes: composition, biogenesis and function." Nat Rev Immunol2(8): 569-579.2002

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3.Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities." Nat Rev Drug Discov12(5): 347-357.2013

4.Human umbilical cord mesenchymal stem cells and exosomes: bioactive ways of tissue injury repair[J].Am J Transl Res. 11(3): 1230–1240.2019;

5. Forsberg M H , Kink J A , Hematti P , et al. Mesenchymal Stromal Cells and Exosomes: Progress and Challenges[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2020, 8.

6.

誰持彩練當(dāng)空舞 ：干細(xì)胞基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展

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