酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理和類(lèi)型

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種免疫分析技術(shù)，廣泛用于測(cè)定液體樣品中的蛋白質(zhì)、抗體或激素。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的標(biāo)準(zhǔn)程序是將蛋白質(zhì)、抗體或激素(即抗原)直接或用捕獲抗體(捕獲Ab)固定在固體載體上，然后加入初級(jí)檢測(cè)抗體(初級(jí)檢測(cè)Ab)形成抗原-抗體復(fù)合物。如果抗體已經(jīng)被酶標(biāo)記，可以直接用于確定抗原的量，否則，可以使用另一種酶標(biāo)記的二級(jí)抗體來(lái)確定抗原的量。測(cè)定抗原量的方法是加入酶的底物，作用后產(chǎn)生的顏色與樣品中抗原的量成正比。根據(jù)這一原理，可以計(jì)算出樣品中抗原的總量或濃度。

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1.直接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

抗原的總量可以通過(guò)直接將抗原固定在固體載體上，加入酶標(biāo)記的一級(jí)抗體來(lái)確定。這種一級(jí)抗體的特異性非常重要。

優(yōu)點(diǎn):操作程序短，無(wú)需使用二抗即可避免相互作用。

缺點(diǎn):實(shí)驗(yàn)中所有一級(jí)抗體都要用酶標(biāo)記，但不是每種抗體都適合標(biāo)記，成本相對(duì)增加。

2.間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

這種測(cè)定方法和直接法類(lèi)似，不同的是一級(jí)抗體沒(méi)有酶標(biāo)記，用酶標(biāo)記的二級(jí)抗體鑒定一級(jí)抗體來(lái)確定抗原的量。

優(yōu)點(diǎn):二抗可以增強(qiáng)信號(hào)，有多種選擇可以做不同的測(cè)定和分析。沒(méi)有酶標(biāo)記的一級(jí)抗體能保持最大的免疫反應(yīng)性。

缺點(diǎn):互動(dòng)概率高。

3.夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

被檢測(cè)的抗原包被在兩個(gè)抗體之間，其中一個(gè)抗體將抗原固定在固體載體上，即捕獲抗體。另一種是檢測(cè)抗體，可以用酶標(biāo)記，直接測(cè)抗原量；或者未標(biāo)記，然后通過(guò)酶標(biāo)記的二級(jí)抗體確定抗原的量。必須仔細(xì)選擇這兩種抗體，以避免對(duì)同一抗原結(jié)合位點(diǎn)的相互作用或競(jìng)爭(zhēng)。

優(yōu)點(diǎn):靈敏度高，特異性高，抗原無(wú)需預(yù)先純化。

缺點(diǎn):一個(gè)抗原必須有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合位點(diǎn)。

4.競(jìng)爭(zhēng)法(競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))

樣品中的抗原(游離抗原)與純化并固定在固體載體上的抗原(固定抗原)競(jìng)爭(zhēng)相同的抗體。當(dāng)樣品中游離抗原較多時(shí)，能結(jié)合的抗體較多，而固定抗原只能結(jié)合較少的抗體，反之亦然。洗滌步驟后，將游離抗原和抗體的復(fù)合物洗去，只留下固定抗原和抗體的復(fù)合物，與僅固定抗原的對(duì)照組的結(jié)果進(jìn)行比較，根據(jù)色差可以計(jì)算出樣品中的抗原含量。

優(yōu)點(diǎn):適用于不純樣品，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性高。

缺點(diǎn):整體靈敏度和特異性差。

5.最新的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

基于細(xì)胞的ELISA:是一種新的蛋白質(zhì)定性檢測(cè)技術(shù)，直接在微孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，不需要提取蛋白質(zhì)和裂解細(xì)胞，直接測(cè)定刺激或抑制后微孔板中蛋白質(zhì)的變化。

優(yōu)點(diǎn):不需要裂解細(xì)胞，所以靶蛋白損失最小，可以確定全細(xì)胞、貼壁細(xì)胞和非貼壁細(xì)胞。

缺點(diǎn):抗原量無(wú)法確定。

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