單細(xì)胞測序技術(shù)于2009年問世。自2013年被《自然方法》雜志評(píng)為年度技術(shù)以來，它在科學(xué)研究中的應(yīng)用越來越多。

2015年以來，10X基因組學(xué)、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技術(shù)的出現(xiàn)，徹底降低了單細(xì)胞測序的成本門檻。

此后，單細(xì)胞測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究和臨床研究。單細(xì)胞在許多領(lǐng)域都占有一席之地，對(duì)癌癥的早期診斷、隨訪和個(gè)體化治療具有重要意義。

一、基本原則

首先，單細(xì)胞測序并不是只對(duì)一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測序，而是可以對(duì)單個(gè)細(xì)胞的基因組或轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，可以理解為單細(xì)胞水平的測序。

在介紹基本原理之前，我們先試著回答一下:為什么要對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行測序？換句話說，單細(xì)胞測序技術(shù)能解決哪些傳統(tǒng)方法無法解決的問題？

世界上沒有兩片完全相同的葉子。對(duì)于多細(xì)胞生物來說，細(xì)胞之間是有區(qū)別的，往往是基因組和轉(zhuǎn)錄組上的幾分錢，功能上的幾千里。

例如，在腫瘤組織中，腫瘤中心的細(xì)胞和腫瘤周圍的細(xì)胞之間，以及原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的細(xì)胞之間，存在基因組和轉(zhuǎn)錄組等遺傳信息的差異，從而導(dǎo)致免疫特性、生長速度、侵襲能力等方面的表型差異。并最終導(dǎo)致對(duì)不同抗腫瘤藥物或放療敏感性的不同。

那么我們?nèi)绾窝芯窟z傳信息的異質(zhì)性呢？傳統(tǒng)的測序方法是在多細(xì)胞水平上進(jìn)行的，這使得每個(gè)人都丟失了異質(zhì)信息，單細(xì)胞測序可以很好的解決這個(gè)問題。舉個(gè)更生動(dòng)的例子:

蛋白質(zhì)印跡檢測

雖然這三個(gè)樣本之間有很多差異，但我們得出的結(jié)論是，該基因在不同組織中的表達(dá)基本相同。上圖所示的異構(gòu)信息完全忽略。

與western blot類似，傳統(tǒng)測序方法顯示的信息也是多細(xì)胞水平的平均信息，而單細(xì)胞水平的測序可以完全反映同一細(xì)胞群中不同細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組。

隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的出現(xiàn)，從混合樣本中篩選異質(zhì)信息的問題得以解決，該技術(shù)的成熟應(yīng)用必將使生命科學(xué)研究向前邁出一大步。

那么單細(xì)胞測序是如何實(shí)現(xiàn)的呢？以單細(xì)胞RNA-seq為例，我們簡單介紹一下實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的原理:

1.分離單細(xì)胞，分別構(gòu)建測序文庫，測序。這種思維通量極低，成本極高。如上所述，燒很多錢會(huì)測幾十個(gè)細(xì)胞，往往不足以反映真正的科學(xué)問題。所以我們把重點(diǎn)放在第二個(gè)選項(xiàng)上。

2.基于標(biāo)簽的單細(xì)胞識(shí)別。它的核心思想是在逆轉(zhuǎn)錄過程中給每個(gè)細(xì)胞添加一個(gè)獨(dú)特的標(biāo)簽序列，然后對(duì)其mRNA進(jìn)行測序。這樣，即使我們混合測序，也可以認(rèn)為攜帶相同標(biāo)簽序列的RNA片段來自同一細(xì)胞。利用這種策略，我們可以通過一次建立數(shù)據(jù)庫來測量數(shù)萬個(gè)單細(xì)胞的信息。

單細(xì)胞測序給大家?guī)砹耸裁春锰?？就拿大家比較關(guān)注的單細(xì)胞RNA-seq來說:

1.在傳統(tǒng)的研究方法中，我們經(jīng)常根據(jù)標(biāo)記基因和細(xì)胞形態(tài)來區(qū)分不同的細(xì)胞類型，但這種方法無疑是有爭議的。單細(xì)胞測序技術(shù)可以更準(zhǔn)確、無偏倚地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類。特別是免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)方面的研究，會(huì)帶來很大的影響。

2.分析稀有細(xì)胞，尤其是特定時(shí)間空環(huán)境下的細(xì)胞。如從環(huán)境中取樣的微生物。

3.臨床上，體外受精胚胎在植入前進(jìn)行篩選。

4.基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞診斷癌癥，大力推廣新型循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)。尤其是治療前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞類型和數(shù)量的變化具有重要的預(yù)后價(jià)值。

5.大規(guī)模測序是通過傳統(tǒng)的測序方法進(jìn)行的。希望利用這些數(shù)據(jù)沖擊重量級(jí)期刊的小伙伴們注意，單細(xì)胞測序已經(jīng)成為高分期刊出版的井噴，技術(shù)在幾年后會(huì)更加成熟。

2.要實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，需要解決兩個(gè)難題:

1.PCR偏倚:單個(gè)細(xì)胞含有約10pg的總RNA，80%以上的信息是rRNA。從單細(xì)胞RNA到文庫，意味著核酸的擴(kuò)增量要達(dá)到一百萬倍以上。然而，在這種高擴(kuò)增水平下，不引入聚合酶鏈反應(yīng)偏差始終是一個(gè)大問題。

我們可以考慮一下。如果兩個(gè)樣本的基因表達(dá)相同，但A和B的擴(kuò)增效率分別為99%和97%，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，兩者相差1.84倍。我們?cè)诜治霾町惢虻臅r(shí)候，如果選擇1.5倍作為差異基因的標(biāo)準(zhǔn)，那么沒有差異的基因就會(huì)有差異。

2.去除rRNA:rRNA占總RNA的80%以上。如果不加選擇地進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、再擴(kuò)增和建立數(shù)據(jù)庫，通過測序獲得的大多數(shù)序列可能是rRNA序列。但是，一般來說，如果你更關(guān)心編碼基因的序列，比如mRNA，rRNA序列并不能給我們帶來有效的信息，可以說是沒有用的。

分別介紹了以下三種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù):

智能放大技術(shù):

SMART擴(kuò)增技術(shù)的核心技術(shù)是設(shè)計(jì)兩個(gè)專用引物。結(jié)合MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

專用引物1由中間的polyte序列加上一個(gè)通用序列和3’端的兩個(gè)簡并堿基組成，但polyte 3’端倒數(shù)第二個(gè)堿基是A、C、G的簡并堿基而不是T，倒數(shù)第二個(gè)堿基是簡并堿基。這樣做的好處是可以在mRNA的3’端和聚(A)的尾部的連接處結(jié)合，而在mRNA的其他地方不結(jié)合。這確保了逆轉(zhuǎn)錄的起始位置恰好是在mRNA 3’末端的序列終止位置。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶有一個(gè)特點(diǎn)，當(dāng)它被轉(zhuǎn)錄到基因的5’端時(shí)，它會(huì)在新合成的基因的3’端增加幾個(gè)碳?jí)A基。

專用引物2由一個(gè)通用序列和其3’端的三個(gè)非脫氧G堿基組成，即RNA和RNA的G堿基，而不是DNA的G堿基。該引物可以與新合成的cDNA 3’端的幾個(gè)碳?jí)A基互補(bǔ)雜交，然后引導(dǎo)該MMLV酶再次進(jìn)行聚合。復(fù)制的結(jié)果是獲得雙鏈cDNA。

這種雙鏈cDNA的兩端已經(jīng)與我們?cè)O(shè)計(jì)的PCR引物序列相連，然后加入常規(guī)的PCR引物進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增和常規(guī)的PCR擴(kuò)增，獲得大量的DNA。然后，像傳統(tǒng)的DNA數(shù)據(jù)庫一樣，它可以被超聲波中斷，在計(jì)算機(jī)上建立和測序。

SMART技術(shù)獲得的主要信息是mRNA信息，大部分LncRNA信息都會(huì)丟失。SMART技術(shù)對(duì)RNA的質(zhì)量要求很高，如果RNA被降解，mrna 5’端的信息就會(huì)丟失。通用引物技術(shù)可以保證擴(kuò)增的均勻性，但不能分析PCR引入的突變。

10倍基因組技術(shù):

首先，將特定的脫氧核糖核酸片段接種在凝膠珠上，凝膠珠由三部分組成:條形碼、UMI和多聚體。條形碼長度為16個(gè)堿基。條形碼有400萬種，一個(gè)微珠對(duì)應(yīng)一種條形碼。通過這400萬種條形碼，可以區(qū)分凝膠微珠。UMI是一個(gè)隨機(jī)序列，這意味著每個(gè)DNA分子都有自己的UMI序列。UMI有10個(gè)堿基長，有100萬種序列變化。UMI的功能是區(qū)分哪些讀數(shù)來自原始的基因分子，基因片段是重復(fù)的還是復(fù)制的，它們是真正的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)還是聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)生的突變。單個(gè)細(xì)胞和單個(gè)凝膠珠用10×基因組學(xué)儀器通過油相混合在一起，形成油包水的小液滴，然后細(xì)胞膜破裂，釋放細(xì)胞中的mRNA。游離的基因與水滴中的水相混合，也就是說，它與逆轉(zhuǎn)錄酶、結(jié)合在凝膠珠上的核酸引物和脫氧核糖核酸底物接觸。

然后，發(fā)生反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。mRNA與凝膠珠上標(biāo)記的DNA分子結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反向轉(zhuǎn)錄。將這種乳液中的水相全部泵出，也就是將所有標(biāo)記好的cDNA分子全部泵出，然后將這些cDNA分子加上接頭，經(jīng)PCR擴(kuò)增，制成illumina測序文庫，放在Illumina測序儀上測序。測序后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

10×基因組學(xué)技術(shù)可以一次性獲得大量的大細(xì)胞數(shù)據(jù)，但只能獲得mRNA信息，LncRNA的大部分信息丟失。UMI技術(shù)可以很好地去除被認(rèn)為是由分析和聚合酶鏈反應(yīng)中的重復(fù)引入的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。RNA的質(zhì)量也高，降解也會(huì)造成5’-末端信息的丟失。

任何耗盡技術(shù)

Anydeplete技術(shù)首先使用隨機(jī)引物進(jìn)行單鏈合成。核苷酸類似物被引入到單鏈合成中用于酶消化，核苷酸類似物也被引入到雙鏈合成中以確保鏈特異性。然后，在兩端添加一個(gè)接頭，接頭的一條鏈還攜帶用于酶促降解的核苷酸類似物。形成單鏈文庫時(shí)，設(shè)計(jì)特異性引物與rRNA形成的文庫結(jié)合，經(jīng)過一輪退火延伸，rRNA文庫形成雙鏈結(jié)構(gòu)。反向接頭上有特定的限制位點(diǎn)。當(dāng)識(shí)別出限制性位點(diǎn)并切斷接頭時(shí)，由rRNA形成的文庫不具有完整的接頭，而其它文庫具有完整的接頭。通過聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增和富集，可以獲得所需的信息。和10×基因組學(xué)一樣，any delinet技術(shù)包含分子標(biāo)簽，可以分析復(fù)制和PCR產(chǎn)生的突變位點(diǎn)。

anydelete技術(shù)可用于可降解樣品，確保5’端和3’端信息的完整性，同時(shí)獲得mRNA和LncRNA信息。如果只需要基因信息，任何刪除技術(shù)都會(huì)造成一些數(shù)據(jù)浪費(fèi)。

參考:

1 . https://www . Sohu . com/a/332085879 _ 811044