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正文

Nature Methods這樣評價長期技術(shù)。

:利用干細胞直接誘導，建立了三維組織模型，為人類生物學研究提供了強有力的方法，目前對這種工具的研究正在不斷發(fā)展。

撰文：Vivian

來源：藍色彩虹

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類器官（Organoid）是一種3D的細胞培養(yǎng)物，在結(jié)構(gòu)以及功能上高度模擬人體器官，能夠形成器官類似的空間結(jié)構(gòu)并且分化出對應(yīng)功能，具備細胞增殖分化、自我更新、自組裝、可長期培養(yǎng)、遺傳穩(wěn)定性等特點。

2009年是類器官領(lǐng)域的元年，類器官鼻祖Hans Clevers發(fā)表了重磅研究成果，成功從LGR5+的小腸干細胞中培養(yǎng)出了小腸類器官。隨著類器官研究的不斷深入，腫瘤類器官類別已經(jīng)可以廣泛覆蓋各個實體瘤癌種，類器官技術(shù)也在2017年被Nature Method 評為年度生命科學領(lǐng)域的年度技術(shù)。

本篇介紹作為“患者替身”進行試藥的類器官腫瘤藥篩模型。類器官具有高度的臨床相關(guān)性，可以在短時間內(nèi)高效開展患者的藥敏檢測，使個性化的腫瘤用藥指導成為可能。

圖1: 不同細胞來源的類器官及應(yīng)用（Sigma-Aldirch）

1 類器官藥篩模型

一個關(guān)鍵問題，為什么不繼續(xù)使用現(xiàn)有2D細胞模型或PDX藥篩模型？

永生化細胞系，可以檢測靶點的結(jié)合情況以及細胞的活性，但是2D細胞模型體外擴增有一定局限性，在傳代后容易喪失原腫瘤的遺傳異質(zhì)性，容易發(fā)生優(yōu)勢克隆選擇，且臨床相關(guān)性較低。

人源性動物移植模型（PDX），是將腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)的腫瘤模型。主要問題有移植的成功率較低、構(gòu)建成本高、周期長，對于藥物篩選的通量有很大局限性。另外，免疫缺陷小鼠體內(nèi)腫瘤微環(huán)境和人體有一定差距，移植的腫瘤組織還可能發(fā)生小鼠樣進化。

腫瘤臨床上可以推廣的藥篩模型必須能夠滿足三大基本要求包括需要在短時間內(nèi)出具藥敏檢測結(jié)果、藥物篩查通量高、預測效果準確，而類器官在這三方面對比其他藥篩方法都顯現(xiàn)出了強勁優(yōu)勢[1]。

• 速度快：類器官構(gòu)建成功率高以及培養(yǎng)速度快。常規(guī)來說，在類器官培養(yǎng)一周之后就可以進行藥篩。從樣本采集到出具藥敏結(jié)果的全流程已經(jīng)可以很好地控制在2周之內(nèi)。

• 通量高：從可篩查的藥物通量來說，利用類器官不僅可以在孔板上進行多種藥物的篩查，每個藥物還可以測試不同的濃度，多個實驗平行開展。

• 臨床相關(guān)性強：類器官用于癌癥藥篩的臨床相關(guān)性和預測有效性在多篇研究中都已經(jīng)得到了較為充分的證實。Vlachogiannis G團隊在Science發(fā)表了腫瘤類器官體外藥敏測試指導臨床用藥的里程碑式研究，在71位轉(zhuǎn)移性胃腸道癌提取了110份組織構(gòu)建了類器官，共測試了55種抗癌藥物。研究結(jié)果顯示，類器官藥篩達到了93%的特異性，100%的靈敏度、88%的陽性預測率和100%的陰性預測率，展現(xiàn)了極高的臨床相關(guān)性[2]。

表1.藥篩模型對比（奇跡之光整理）

2 腫瘤類器官藥敏檢測流程

腫瘤類器官進行藥篩的流程，包括類器官的構(gòu)建、評估、藥敏檢測三大方面：

類器官的構(gòu)建

類器官的樣本來源通常為腫瘤組織或者胸腹水等惡性積液，主流的培養(yǎng)方法包括較為常用的正置膠滴法、適用于腫瘤和睪丸類器官培養(yǎng)的倒置膠滴法、適用于有氣體接觸的黏膜類器官（腸、呼吸道）培養(yǎng)的氣液界面法以及需要較大擴增（腦類器官）的生物反應(yīng)器法等。

以腸道腫瘤類器官的培養(yǎng)流程為例，首先將患者來源的腫瘤樣本組織通過機械剪切得到腫瘤細胞團，再將細胞團酶消化成單細胞。分離消化后，將細胞嵌入到基質(zhì)膠中并在96/384孔板上進行膠滴的種接，再覆蓋以培養(yǎng)基和細胞因子培養(yǎng)。類器官培養(yǎng)至直徑幾百微米的細胞小球即可用于藥篩。類器官培養(yǎng)特有的重要試劑包括消化液、培養(yǎng)基（例如Wnt、R-Spondin、Noggin等細胞因子）、基質(zhì)膠（Matrigel等），這些試劑在不同實驗室、公司以及培養(yǎng)不同種類的類器官之間的差異性較大。

類器官培養(yǎng)過程中添加生長因子的組合需要進行仔細考量，否則失之毫厘，謬以千里。

圖2：腸道腫瘤類器官的培養(yǎng)流程（[3]）

類器官的評估

在培養(yǎng)好類器官之后，對于類器官的評估和驗證也至關(guān)重要。通過基因測序、免疫熒光、HE染色等方法，從形態(tài)學、組織病理學以及分子遺傳學等多個維度對類器官進行鑒定。評估的目的是確定類器官和原腫瘤具有一致性，這也是進行后續(xù)藥篩的前提。

類器官的藥敏檢測

類器官目前可篩選的藥物種類包括化療藥、小分子靶向藥、抗體藥物等。藥篩的核心檢測檢測指標，通常為IC50以及細胞抑制率，根據(jù)這些指標在篩查的藥物中選取對腫瘤抑制效果最佳的藥物。

國內(nèi)外目前，共有超過40項類器官臨床相關(guān)研究，研究單位和臨床注冊主體多為醫(yī)院。如圖3所示，在中國的注冊臨床中，類器官以化療藥的敏感性檢測作為主流應(yīng)用，類器官用于檢測靶向藥和免疫治療的敏感性在未來還有極大的發(fā)揮空間和應(yīng)用潛力。

圖3. 國內(nèi)類器官臨床注冊實驗藥物類型統(tǒng)計（奇跡之光整理）

3 類器官藥篩的產(chǎn)業(yè)化現(xiàn)狀

類器官應(yīng)用前景廣闊。從疾病研究角度來看，類器官可以為組織發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和發(fā)病機制的研究提供更基礎(chǔ)、更為功能化的指導，同時，也會為疾病診斷與治療提供一種新思路。

類器官產(chǎn)業(yè)鏈

產(chǎn)業(yè)鏈上游，以提供類器官培養(yǎng)的耗材（包括培養(yǎng)基、細胞生長因子、凍存液、消化液、基質(zhì)膠等）和設(shè)備為主。其中包括老牌的STEMCELL Technologies等細胞試劑提供商和專注于提供類器官試劑的新興公司（如Prellis Biologics的血管化3D Scaffold、X cell Biosciences的微環(huán)境模擬系統(tǒng)等）。

產(chǎn)業(yè)鏈中游，以提供人或者動物類器官的培養(yǎng)、類器官的凍存建庫以及類器官的傳代的服務(wù)為主。

產(chǎn)業(yè)鏈下游，致力于類器官應(yīng)用的公司通過和藥企合作進行新藥研發(fā)，或者建立患者來源的類器官進行腫瘤藥敏篩查，數(shù)量并不很多。國外比較有代表性的下游公司包括美國的System 1 Biosciences公司，在2018年末獲得了Pfizer Ventures和CRV共同領(lǐng)投的2500萬美元的A輪投資，主要開發(fā)神經(jīng)細胞類的類器官用于藥物開發(fā)。

從投融資次數(shù)和金額來看，類器官整個行業(yè)都還處于比較早期的階段，競爭剛剛起步，還有很多機會。

中國類器官產(chǎn)業(yè)化

類器官應(yīng)用于藥篩的頭部公司，需要具備泛癌種培養(yǎng)能力以及達到商業(yè)轉(zhuǎn)化水平的穩(wěn)定性的水平，有嚴格的質(zhì)量控制和標準化體系，且在培養(yǎng)涉及的儀器和鑒定篩選平臺方面需要往自動化方向靠攏。

參考表2可以發(fā)現(xiàn)，國外專注類器官的公司數(shù)量較少，不少公司原來的主營方向為干細胞相關(guān)的業(yè)務(wù)，后續(xù)才拓展出了類器官板塊。由于上述壁壘，國內(nèi)開展腫瘤藥篩的類器官公司數(shù)量也并不多，但是融資成功的公司（如科途、創(chuàng)芯等）都具備自主研發(fā)創(chuàng)新類器官耗材的能力，在類器官培養(yǎng)的各個環(huán)節(jié)中都掌握著自己特有的know-how，在產(chǎn)業(yè)化方面的進展對比國外并沒有明顯的落后趨勢。

另一發(fā)展契機在于，目前國內(nèi)外行業(yè)都還沒有建立完善標準，因此中國類器官公司以及研究機構(gòu)在類器官技術(shù)的標準化以及應(yīng)用指南的建立等方面可以積極參與，未來在行業(yè)中可掌握主導優(yōu)勢和話語權(quán)。

中國類器官科研

類器官行業(yè)在歐洲國家發(fā)展較為迅速，這和歐洲類器官科研最早起步以及積累最多息息相關(guān)。

類器官的領(lǐng)頭人Hans Clevers成立的Hubrecht Organoid Technology（HUB）是類器官最早的研發(fā)中心，HUB技術(shù)授權(quán)促進了Epistem、Cellesce、Crown Biosciences、STEMCELL Technologies在內(nèi)的一批類器官公司的涌現(xiàn)。

中國在類器官領(lǐng)域中，近年來呈現(xiàn)出科研數(shù)量大幅度上升的趨勢，尤其在2019-2020年這兩年間顯現(xiàn)出了強勁的發(fā)展勢頭，發(fā)表的文獻數(shù)量在全球的排名從第六位（2009-2019年）躍至第二位（2020年），僅次于美國。參考歐洲的類器官發(fā)展模式，可以預計中國基礎(chǔ)科研積累的提升將加速類器官產(chǎn)業(yè)化的進程，在不遠的將來我們也將看到更多類器官公司的涌現(xiàn)。

表2.國內(nèi)外類器官公司（奇跡之光整理）

4 類器官的產(chǎn)業(yè)化策略

類器官藥篩可與二代測序作為組合產(chǎn)品使用，在臨床上可有機結(jié)合，相輔相成。二代測序從基因?qū)用嫔蠙z測出患者的靶點突變情況和潛在的藥物敏感靶點，為醫(yī)生和患者提供初步用藥選擇，但是單憑二代測序結(jié)果無法保證完全的臨床療效。部分報道指出，二代測序篩出的潛在靶向藥并沒有在實際臨床上反應(yīng)出有效性，這一不確定性通過類器官可以得到很好排查。

例如，Vlachogiannis G課題組分析了一例KRAS野生型CRC患者的治療過程，針對這類型基因檢測結(jié)果的患者通常采用抗EGFR的藥物進行治療，然而類器官在抗EFGR的藥敏檢測中推翻了這一結(jié)論，在實際臨床情況中也觀測到了和類器官篩查結(jié)果一致的結(jié)果[2]。

其次，基因檢測的確能夠提供很多數(shù)據(jù)，但是對于用藥指導來說，在測序結(jié)果上選出的幾個靶向藥之間要如何抉擇、單靶向藥是否足夠解決問題、連用的話哪種組合方案更優(yōu)等問題并不能給出結(jié)論性意見，還需要依靠臨床醫(yī)生權(quán)衡治療收益和風險進行主觀判斷，因此某種程度上反而將問題復雜化了。

類器官作為藥敏驗證的手段，可以在測序基礎(chǔ)上進一步鎖定有效藥物，給出結(jié)論性建議以及實際證據(jù)。二代測序是根據(jù)基因數(shù)據(jù)從源頭尋找結(jié)果的過程，而類器官是結(jié)果導向的過程：畢竟是騾子是馬，拉出來溜溜就知道了。

圖4. 類器官結(jié)合二代測序進行腫瘤藥篩（[8]）

5 關(guān)注重點和發(fā)展方向

類器官培養(yǎng)試劑性能和成本

類器官作為新型的藥篩模型，成本雖然較PDX更低，但還是遠高于細胞系。類器官成本占比較高的包括培養(yǎng)使用的基質(zhì)膠。

常用的基質(zhì)膠為美國BD Biosciences公司的Matrigel?，在行業(yè)內(nèi)處于較為壟斷的地位，價格較高。Matrigel可以產(chǎn)生類似于哺乳動物細胞基底膜的生物活性基質(zhì)材料，幫助多種類型的細胞達到附著和分化。Matrigel的來源是小鼠肉瘤細胞系，除了成本較高的問題，同時批次間存在一定的變異性。且由于是動物來源，對于有機類的藥物的檢測有局限性?？紤]到小鼠來源的細胞外基質(zhì)對于藥物篩選實驗結(jié)果存在一定的干擾，因此基質(zhì)的工程技術(shù)開發(fā)用于合成外源差異較小的、非動物來源的基質(zhì)膠用于成本下降和性能優(yōu)化將是類器官產(chǎn)業(yè)化需要解決的關(guān)鍵性問題之一。

基質(zhì)膠以外，培養(yǎng)也涉及多種細胞因子組合使用，細胞生長因子通常也價格不菲。選擇效果更好的細胞因子以及嘗試減少使用細胞因子的數(shù)量也可以帶來成本下降的空間。

類器官臨床應(yīng)用的困境

• 血管化。目前大多類器官本身并不具備血管化的結(jié)構(gòu)。因此，隨著類器官體積的增長，類器官受限于氧氣的缺失以及代謝廢物的增加，可能導致的組織壞死。已有研究構(gòu)建血管內(nèi)皮細胞微環(huán)境的腫瘤類器官，將類器官腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞在Matrigel上共同培養(yǎng)，生成血管結(jié)構(gòu)以期解決類器官血管化缺失的問題。

• 免疫化。血管化以外的難點還包括模擬腫瘤和免疫環(huán)境的相互作用關(guān)系。2019年Nature Protocol發(fā)表了腫瘤類器官和免疫細胞共同培養(yǎng)的相關(guān)protocol，可以體現(xiàn)和模擬出腫瘤微環(huán)境的部分特征[5]。以上皮類器官和免疫細胞共培養(yǎng)模型為例，可通過在培養(yǎng)基中添加活化的免疫細胞、在組織消化成單細胞后和免疫細胞共同生長、添加ECM中的重組細胞因子等方法重塑類器官和免疫細胞的相互作用。

• 系統(tǒng)化。相比于單個類器官，類器官系統(tǒng)的構(gòu)建能夠?qū)λ幬锆熜Ш蜐撛诙拘宰龀龈暾娴脑u估。目前類器官僅能檢測出藥物對于腫瘤的抑制效果，對于其他器官組織是否存在其他副作用和安全性風險并不能做出預判。為了解決這一問題，2017年Skardal et al.構(gòu)建了有心臟、肺部、肝臟組成的集成于閉合循環(huán)關(guān)注體中的類器官系統(tǒng)，以達到全面揭示藥物對不同器官的毒性和藥效的目的[6]。

從臨床應(yīng)用的角度分析，類器官很難完美模擬出原腫瘤的全部功能。腫瘤組織在人體中是高度異質(zhì)性的復雜存在，但是對于預測藥敏的關(guān)鍵指標來說（如細胞抑制率），類器官只需要達到一定程度的復雜性即可給出較好的答案。

以血管化來說，類器官在培養(yǎng)至2個月左右，如果缺乏營養(yǎng)供給，會和體內(nèi)器官形成較大差異，但是對于藥篩來說只要類器官在合適的環(huán)境中生長至細胞小球即可用于藥篩。

又比如說，如果某個藥物的研究重點是需要跨越血腦屏障，那么腦類器官構(gòu)建重點便是需要有完整的血腦屏障結(jié)構(gòu)，對于其他特征（如細胞和周圍血管的相互作用）可能并不會優(yōu)先考慮。

血管化、免疫共培養(yǎng)以及系統(tǒng)化的實現(xiàn)可以進一步提高類器官臨床預測的準確性，但考慮到周期、成本等關(guān)鍵應(yīng)用因素，尚且無法兼顧所有條件。有朝一日，如果這些特征都能在成本周期可控的情況下實現(xiàn)，類器官藥篩將能夠提供更加準確的答案。

類器官藥篩標準化

取樣標準化

標準化的第一步即類器官取樣。腫瘤組織取樣的部分非常關(guān)鍵，初始的樣本量及細胞質(zhì)量直接決定了類器官培養(yǎng)的成功率。樣本需要高活性和干性的細胞，對于腫瘤組織來說，最好是來源于干細胞。外層的細胞處于分化的終末期，干性較差；而位于內(nèi)層的細胞常常處于缺氧壞死的狀態(tài)，活性較差。

以胰腺癌為例，只有小于20%的患者能夠通過根治性手術(shù)切除獲得腫瘤切除樣本。余下高達80%的患者發(fā)現(xiàn)即為中晚期，無法通過手術(shù)獲得足量的組織樣本，類器官樣本常常通過超聲內(nèi)鏡引導下的細針穿刺活檢（EUS-FNA）獲取。

EUS-FNA穿刺獲得的樣本量較手術(shù)中穿刺的更少，同時還與臨床操作醫(yī)生的經(jīng)驗相關(guān)。如果穿刺樣本量很少、活細胞數(shù)量較少、或者沒有穿刺到陽性的細胞群，類器官的構(gòu)建都會面臨著較大挑戰(zhàn)。對于在腫瘤的什么病灶取什么樣本、樣本需要滿足什么樣的條件等需要建立嚴格的標準以保證后續(xù)類器官培養(yǎng)的成功。

全程自動化

類器官從取樣到藥篩的每一個步驟都需要嚴格把控，對于標準化有很高的要求，可以推測未來類器官培養(yǎng)環(huán)節(jié)也將提高自動化程度，盡可能提高類器官的可重復性。

在類器官的藥敏檢測流程中已經(jīng)介紹了類器官需要在凝膠狀Matrigel中嵌入生長，物理參數(shù)和生長因子可及性的局部差異可能帶來類器官在形狀、大小和分布等方面的差異性，而臨床上藥篩類器官的應(yīng)用需要達到較高的均一性。Lutolf et al.發(fā)表了關(guān)于類器官培養(yǎng)的自動化技術(shù)，采用了非固態(tài)的基質(zhì)，構(gòu)建了微型工程的水凝膠細胞培養(yǎng)裝置。對比傳統(tǒng)的Matrigel，非固體的基質(zhì)使得類器官的均一性和可重復性得到提高，同時也為下游的分析提供了便利性[7]。

另外，在類器官鑒定中，采取人工智能的判讀對類器官活性、大小等主要參數(shù)進行評估，可以同時保證有效性和時效性，進一步縮短整個類器官藥篩流程的周期。類器官只有在建立完善的技術(shù)標準體系后，類器官的相關(guān)研究才能被進一步推動，類器官產(chǎn)業(yè)化才得以發(fā)展。

6 文末小結(jié)

古有神農(nóng)嘗百草，今有類器官作為患者替身試百藥。作為一種新型的藥物篩選和藥敏檢測模型，類器官應(yīng)用在近兩年來初露鋒芒。

類器官技術(shù)自2009年來歷經(jīng)了應(yīng)用拓展，已經(jīng)可以在2周的時間內(nèi)進行腫瘤藥物篩選，為患者提供準確可靠的用藥指導建議，在時效性、可篩藥物通量、臨床相關(guān)性等參數(shù)方面明顯優(yōu)于其他藥物模型。

目前，類器官技術(shù)在臨床產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用尚且處于小荷才露尖尖角的狀態(tài)，國內(nèi)外真正具備培養(yǎng)和鑒定類器官及開發(fā)類器官藥篩的公司數(shù)量并不多，產(chǎn)業(yè)化的推進還需要解決成本、標準化等限制性因素。隨著行業(yè)規(guī)范的完善和更多臨床數(shù)據(jù)的積累，類器官藥篩應(yīng)用在臨床上的廣泛開展未來可期。

資料來源：

[1] Li, Mo, and Juan C. Izpisua Belmonte. “Organoids — Preclinical Models of Human Disease.” New England Journal of Medicine, vol. 380, no. 6, 2019, pp. 569–579.,

[2] Vlachogiannis, Georgios, et al. “Patient-Derived Organoids Model Treatment Response of Metastatic Gastrointestinal Cancers.” Science, vol. 359, no. 6378, 2018, pp. 920–926.,

[3] Nguyen, Romario, et al. “Application of Organoids in Translational Research of Human Diseases with a Particular Focus on Gastrointestinal Cancers.” Biochimica Et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer, vol. 1873, no. 2, 2020, p. 188350.,

[4] Ye, Shicheng, et al. “A Chemically Defined Hydrogel for Human Liver Organoid Culture.” Advanced Functional Materials, vol. 30, no. 48, 2020, p. 2000893.,

[5] Nature Protocol：Tumor organoid-T-cell coculture systems

[6] Skardal, Aleksander, et al. “Multi-Tissue Interactions in an Integrated Three-Tissue Organ-on-a-Chip Platform.” Scientific Reports, vol. 7, no. 1, 2017,

[7] Brandenberg, Nathalie, et al. “High-Throughput Automated Organoid Culture via Stem-Cell Aggregation in Microcavity Arrays.” Nature Biomedical Engineering, vol. 4, no. 9, 2020, pp. 863–874.,

[8] Es, Hamidreza Aboulkheyr, et al. “Personalized Cancer Medicine: An Organoid Approach.” Trends in Biotechnology, vol. 36, no. 4, 2018, pp. 358–371.,

誰持彩練當空舞 ：干細胞基礎(chǔ)與臨床研究進展

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