THBS1最早發(fā)現(xiàn)于血小板，已經(jīng)證明在包括GBM在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中，它不僅調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的行為，還調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤血管生成。

——摘自文章章節(jié)

【參考文獻(xiàn):Daubon T，et al. Nat Commun。2019年3月8日；10(1):1146.doi:10.1038/s 14467-019-08480-y .】

研究背景

法國波爾多大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所的Thomas Daubon在2019年第10期《自然通訊》上發(fā)表了研究結(jié)果，揭示了基質(zhì)細(xì)胞蛋白家族的凝血酶敏感蛋白-1(THBS1)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。THBS1最早發(fā)現(xiàn)于血小板，已經(jīng)證明在包括GBM在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中，它不僅調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的行為，還調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤血管生成。

研究人員首先發(fā)現(xiàn)THBS1的表達(dá)在不同級別的膠質(zhì)瘤中是不同的。免疫組織化學(xué)(IHC)法檢測THBS1在ⅱ、ⅲ、ⅳ級膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THBS1在GBM中的表達(dá)水平高于ⅱ、ⅲ級膠質(zhì)瘤和正常腦組織。P3人異種移植瘤模型與人GBM非常相似，表現(xiàn)為壞死核心周圍的假柵欄細(xì)胞、血管生成和侵襲。免疫組織化學(xué)顯示P3腫瘤浸潤區(qū)有大量THBS1沉積。

隨后的一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TGFβ1與SMAD3結(jié)合可以調(diào)控THBS1的表達(dá)。首先，用酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞提取物和細(xì)胞外環(huán)境中THBS1的表達(dá)和分泌，結(jié)果表明特異性轉(zhuǎn)化生長因子β1受體抑制劑LY2157299能完全阻斷細(xì)胞裂解液和上清液中轉(zhuǎn)化生長因子β1的誘導(dǎo)。在分析了轉(zhuǎn)化生長因子β1的典型下游信號后，研究人員對P-SMAD2、P-SMAD3和SMAD4進(jìn)行了免疫染色，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β1刺激的所有SMAD蛋白都位于U87核。然而，SMAD3結(jié)合位點(diǎn)僅在人THBS1啟動子中發(fā)現(xiàn)。重要的是，shRNAs沉默SMAD3可以降低轉(zhuǎn)化生長因子β1誘導(dǎo)的THBS1的表達(dá)。當(dāng)?shù)诙€SMAD3結(jié)合位點(diǎn)突變時，THBS1啟動子的活性被抑制。當(dāng)?shù)谝粋€結(jié)合位點(diǎn)突變時，THBS1啟動子的活性增加。結(jié)果表明，典型的轉(zhuǎn)化生長因子β1信號通路通過SMAD3直接調(diào)節(jié)THBS1的轉(zhuǎn)錄活性。

在ⅰ型膠原球的侵襲實(shí)驗(yàn)中，敲除THBS1可顯著降低細(xì)胞的侵襲能力。與對照組相比，THBS1缺失腫瘤的血管類型存在差異。長度小于10米的小型船只數(shù)量減少，而長度在10至20米之間的中型船只數(shù)量增加。與shRNA對照組相比，P3 THBS1-1 shRNA組的腫瘤侵襲能力明顯下降49%，P3 THBS1-2 shRNA組的腫瘤侵襲能力下降76%。轉(zhuǎn)染P3瘤的小鼠存活率顯著提高。為了進(jìn)一步證實(shí)這些結(jié)果，研究人員使用慢病毒載體在P3細(xì)胞中表達(dá)THBS1功能，這表明THBS1過表達(dá)的細(xì)胞的侵襲性通過蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光檢測而增加。

研究人員隨后證實(shí)，缺氧通過激活轉(zhuǎn)化生長因子β1增強(qiáng)了THBS1的表達(dá)。目前，抗血管內(nèi)皮生長因子抗體(貝伐單抗)的抗血管生成作用常用于治療復(fù)發(fā)性GBM。腫瘤缺氧和隨后HIF1α表達(dá)的增加是貝伐單抗體內(nèi)治療的結(jié)果，這可能導(dǎo)致局部侵襲的增加。研究人員進(jìn)一步評估了貝伐單抗治療后THBS1的功能。在未用貝伐單抗治療的P3腫瘤的周邊區(qū)域觀察到THBS1沉積，但在腫瘤核心沒有觀察到。與腫瘤中心相比，THBS1基因在浸潤區(qū)顯著增加。在用貝伐單抗治療的P3腫瘤中，通過蛋白質(zhì)印跡法上調(diào)腫瘤核心中THBS1的表達(dá)。此外，在體外缺氧條件下，P3細(xì)胞和U87細(xì)胞增強(qiáng)了THBS1的表達(dá)。用貝伐單抗治療轉(zhuǎn)染THBS1 shRNA的U87和P3腫瘤，動物模型的存活率明顯提高。

研究人員還發(fā)現(xiàn)CD47/THBS1相互作用參與了GBM的進(jìn)展。由于缺氧可以誘導(dǎo)THBS1的表達(dá)，研究人員在缺氧條件下用TAX2或?qū)φ针闹委烶3腫瘤，發(fā)現(xiàn)TAX2在體外顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲。結(jié)果表明，各治療組血管密度均發(fā)生變化，TAX2+貝伐單抗聯(lián)合用藥對小血管的作用更強(qiáng)。與單用貝伐單抗相比，聯(lián)合治療比單用貝伐單抗更能抑制P3顱內(nèi)腫瘤模型的侵襲。因此，接受聯(lián)合給藥的動物模型的存活率增加。

最后，研究人員通過沉默P3和U87細(xì)胞中的CD47進(jìn)一步證實(shí)CD47是GBM侵襲的關(guān)鍵作用。CD47沉默的P3細(xì)胞對ⅰ型膠原球的侵襲實(shí)驗(yàn)表明，侵襲能力明顯降低。CD47敲除顯著減弱THBS1誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲。此外，植入CD47敲除P3細(xì)胞和對照細(xì)胞的小鼠存活率顯示CD47敲除組的存活時間顯著增加。

結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)THBS1與膠質(zhì)瘤的病理分級有關(guān)。SMAD3通過TGFβ1經(jīng)典途徑與THBS1基因啟動子結(jié)合，從而調(diào)控THBS1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。THBS1沉默可通過單一或聯(lián)合抗血管生成治療抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和生長。CD47敲除試驗(yàn)證實(shí)了拮抗肽對THBS1/CD47相互作用的特異性抑制可以減少細(xì)胞侵襲。激光顯微切割對周圍和中心腫瘤組織的RNA測序表明，THBS1是腫瘤邊界連接性最高的基因之一。根據(jù)研究數(shù)據(jù)，TGFβ1通過SMAD3誘導(dǎo)THBS1的表達(dá)，增強(qiáng)GBM體積擴(kuò)張時的侵襲性，CD47結(jié)合腫瘤細(xì)胞也參與了這一過程。

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