ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）全名為酶聯(lián)免疫斑點檢測，結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，能夠檢測到單個細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子情況。簡單來說，就是用包被好的抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色的方式將其呈現(xiàn)出來。

ELISPOT 實驗原理

ELISPOT 實驗使用 PVDF 膜為底的 96 孔板（cat：MSIPS4510，Millipore），包被上特異性的單克隆抗體（需要無毒，不含內(nèi)毒素，親和力高的抗體），以捕獲細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。

然后在培養(yǎng)板的孔內(nèi)加入待檢測的細(xì)胞和抗原刺激物進(jìn)行培養(yǎng)。在刺激物的刺激下，T 細(xì)胞就會在對應(yīng)的時間段分泌對應(yīng)的細(xì)胞因子。此時細(xì)胞因子就被包被在膜上的抗體所捕獲。

洗去細(xì)胞后，被捕獲的細(xì)胞因子可以與生物素標(biāo)記的第二抗體結(jié)合，然后用酶標(biāo)親和素與生物素結(jié)合，進(jìn)行化學(xué)酶聯(lián)顯色，就可以在膜的局部形成一個個圓形的斑點（當(dāng)然，也可以使用熒光素標(biāo)記的第二抗體，這樣就省去了后續(xù)的化學(xué)顯色方法，并且一次可以檢測多種細(xì)胞因子），每一個斑點就對應(yīng)了當(dāng)初一個分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞。

統(tǒng)計膜上的斑點的數(shù)目，再除以當(dāng)初加入孔內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，就可以計算出陽性細(xì)胞的百分比。

該技術(shù)有以下三大優(yōu)點：

一：靈敏度高。一百萬個細(xì)胞中只要有一個細(xì)胞分泌細(xì)胞因子就可被檢測出來，相對于傳統(tǒng)的 ELISA 方法提升了 2～3 個數(shù)量級。

二：單細(xì)胞水平，活細(xì)胞功能檢測。ELISPOT 是用抗原直接刺激活細(xì)胞，檢測的是活細(xì)胞的功能。

三：操作簡便經(jīng)濟，可進(jìn)行高通量篩選。ELISPOT 沒有復(fù)雜的細(xì)胞體外擴增過程，不使用同位素，按照標(biāo)準(zhǔn)化的實驗操作，一個實驗者可以同時處理數(shù)百個樣品，效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它檢測方法。

以上只是 ELISPOT 的原理，下面直接上干貨：標(biāo)準(zhǔn) protocol。

綜合了 nature protocol（Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays），CTL，mabtech 和其他若干 paper 的經(jīng)驗，寫下了這篇標(biāo)準(zhǔn) protocol，一步步走向成功。

以檢測 IFN-γ 為例，本人已經(jīng)做了 20 多次，屢試不爽，先 show 幾張圖吧：

ELISPOT 實驗步驟

準(zhǔn)備實驗，建立好 plate 布局，至少用 3 個復(fù)孔來測試每一個條件，用 4～6 個復(fù)孔來優(yōu)化陰性對照。

第 1 天

A. 準(zhǔn)備 ELISPOT plate（需要無菌條件）

1. 使用無菌的 pH 7.4 的無鈣鎂離子的 1 × PBS（即 DPBS）（0.22 μm 濾器過濾）稀釋包被抗體（cat：3420-2H，Mabtech）（1-D1K：1 mg/ml）至 15 μg/ml（1.5 μg/100 μl）。

2. 取出 Millipore 96-well PVDF ELISPOT plate（cat：MSIPS4510，Millipore），每孔加入 15 μl 35% 乙醇處理 2 min。

3. 無菌水（0.22 μm 濾器過濾）清洗 plate 5 遍，每次每孔加入 200 μl。

4. 最后一遍棄掉液體后，輕輕在無菌紙上扣干（注意：一定要輕，以防損傷 PVDF 膜）。

5. 每孔加入 100 μl 步驟 1 稀釋的 1-D1K 抗體溶液，4～8 ℃ 孵育過夜。

第 2 天

B. 在 plate 中培養(yǎng)細(xì)胞（需要無菌條件）

6. 準(zhǔn)備細(xì)胞。

如果是液氮凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后計數(shù)，然后在 37 ℃，5% CO2條件下使得細(xì)胞恢復(fù)以達(dá)到一個較高的密度。

注意：culture medium 中的 serum 要預(yù)測試其合適性，因為 serum 的選擇極大影響背景反應(yīng)水平和細(xì)胞的總體反應(yīng)。

7. 準(zhǔn)備刺激物。

ELISPOT 實驗應(yīng)該有的 control：

Con1：只有細(xì)胞 cell alone for background reactivity。

Con2：只有培養(yǎng)基 medium alone for false positive spots。

Con3：細(xì)胞和絲裂原（如 PHA）cell plus motigen for overall assay functionality。

Con4：細(xì)胞和對照多肽庫 cell plus control peptide pool for internal sample control。

Con5：外部趨勢對照，1～2 個參照樣品用以測試培養(yǎng)基，對照抗原和絲裂原 external trending control, typically consisting of 1–2 reference samples tested against medium alone, a control antigen (e.g., peptide pool against which those samples exhibit a detectable response) and mitogen。

Positive control：CEF peptide pool 和 PHA 刺激。

CEF peptide pool（cat：PM-CEF-E，JPT）：先用純的 DMSO（40 μl）溶解，再用 1 × PBS 稀釋到終濃度，DMSO 的終濃度必須小于 1%，以免細(xì)胞毒性。

PHA：先加 1 ml 無菌的 DPBS 或者細(xì)胞培養(yǎng)基到 5 mg 的 PHA 凝集素中，輕輕混勻溶解，使用之前再用無菌的 buffer 稀釋到所需的工作液濃度。注意不要過濾以免損失。

CEF peptide pool 和 PHA 要稀釋到 2 × 的終濃度。

Negative control：培養(yǎng)基 +DMSO，DMSO 濃度和 CEF peptide pool 中終濃度一致。

8. 去除 plate 中的抗體，無菌 PBS 清洗 plate 5 遍，每次每孔 200 μl。

9. 最后一遍棄掉液體后，輕輕在無菌紙上扣干。

10. 封閉 plate：每孔加入 200 μl 1% BSA（0.22 μm 濾器過濾），室溫孵育至少 30 min。

11. 去除封閉液，加入 50 μl CEF peptide pool，PHA，陰性對照和刺激物到合適的孔中。

12. Gently 鋪板細(xì)胞，每孔 50 μl culture medium，2～4 × 105 cell/ml（具體的細(xì)胞數(shù)目需要做梯度摸索），輕拍板的邊緣使得細(xì)胞均勻鋪開，然后放入培養(yǎng)箱，37 ℃，5% CO2培養(yǎng) 16～20 h。

注意 1：步驟 11 和 步驟 12 可以合為一步，即先把細(xì)胞和刺激物混勻后再加入對應(yīng)的孔中。

注意 2：培養(yǎng)期間不要移動 plate，并且采取措施防止蒸發(fā)，可以使用鋁箔紙包裹 plate。

第 3 天

13. 去除 plate well 中的細(xì)胞，然后用 PBS+ 0.05% Tween-20 清洗 well 4～6 遍以完全去除細(xì)胞，每次 200 μl。

注意：細(xì)胞去除不完全會破壞 spot 的形成。

14. 用 0.5% BSA in 1 × PBS 或者 0.5% FCS（胎牛血清）in 1 × PBS 稀釋生物素標(biāo)記的檢測抗體 7-B6-1-biotin 至 1 μg/ml，再用 0.22 μm 低蛋白結(jié)合的濾器過濾，然后每孔加入 100 μl，37 ℃ 孵育至少 2 h。

15. 清洗 plate well，參考步驟 3（第 2 天）。

16. 用 0.5% BSA in 1 × PBS 或者 0.5% FCS（胎牛血清）in 1 × PBS 稀釋鏈霉親和素 -HRP（streptavidin-HRP），每孔加入 100 μl，室溫孵育至少 1 h。

注意 1：根據(jù)顯色底物來決定過氧化物酶結(jié)合物（peroxidase conjugate）的稀釋度。 底物為 AEC，推薦 1:100 稀釋度。底物為 TMB，推薦 1:500～1:1000 稀釋度。

注意 2：HRP 結(jié)合物（HRP-conjugates）不能在含有疊氮化鈉的 buffer 中使用，因為疊氮化鈉會抑制酶的活性。

17. 使用 1 × PBS 清洗 plate well 4～6 遍，每次 200 μl。

注意：不要使用帶有 Tween-20 的 washing buffer，因為 Tween-20 會干擾 spot 的形成。

18. 加入底物 TMB，每孔 100 μl，直至清晰的 spots 出現(xiàn)。

注意：底物 AEC/TMB 稀釋后要用 0.45 μm 濾膜過濾。

19. 用去離子水來終止顯色反應(yīng)。

20. 去除 plate underdrain 上所有多余的液體，用紙巾將孔的背部徹底擦干。

注意：殘留的底物會引起孔中的色斑。

21. plate 在黑暗環(huán)境中過夜，徹底晾干。

22. 使用 ELISPOT reader 觀察計數(shù)。

ELISPOT reader 使用方法

讀板

1. 開機：先開 ELISPOT reader，再開電腦。

2. 選擇 CTL。

3. 選擇掃描軟件，即 capture。

4. 進(jìn)入掃描向?qū)Ｊ?，選擇 plate 類型，MSIP45。

5. 選擇保存路徑，可以修改。

6. 點擊 eject，彈出載物臺，放好 plate。

注意：板子的 A1 孔要和載物臺的 A1 位置對準(zhǔn)，然后在彈出的對話框中命名，點擊 load。

7. 點擊 Preselect Wells，可以選擇列-column，行-row，單孔-single。

8. 修改曝光時間：退出向?qū)?，點擊 preference，這里有儀器的全部設(shè)置。點擊 image capture setting，在 exposure setting 里，勾選 modify exposure time，然后可以修改曝光時間。

9. 選擇 auto center for each well，即相機鏡頭自動對準(zhǔn)樣品孔。

10. 點擊 start，開始讀板。

分析

1. 點擊分析軟件。

2. 進(jìn)入選擇界面。左邊一欄：選擇斑點類型，Normal：背景比較干凈的；Normal diffuse：斑點彌散，有點背景的；中間一欄：counting module，一般選擇智能計數(shù)—smart count；右邊一欄：質(zhì)控-quality control。

3. 點擊 Smart count。

① 選擇板子—load plate

② 定義計數(shù)參數(shù)—define counting parameter

測試斑點識別的精度，即雙擊需要識別的孔即可。

斑點識別的是否精確，否的話需要調(diào)節(jié)參數(shù)，Diffuse processing，有 small，large 等可選；在出現(xiàn)白斑的情況下勾選 fill holes 選項；調(diào)大 spot separation 可以使連接的斑點分離；勾選 hair removal 可以去除頭發(fā)絲狀雜質(zhì)；調(diào)小 count area 可以去掉已經(jīng)選中的孔邊緣深色非斑點部分；勾選 normalize counts 可以根據(jù)斑點的平均分布估算紅圈外未選中區(qū)域的斑點個數(shù)，未勾選則完全刪除紅圈外的斑點個數(shù)，數(shù)字后會有一個 *，* 代表有估算的內(nèi)容在內(nèi)。

點擊 BACK，回到原來界面。

測試斑點識別的精度，即雙擊需要識別的孔即可。

斑點識別的是否精確，否的話需要調(diào)節(jié)參數(shù)，Diffuse processing，有 small，large 等可選；在出現(xiàn)白斑的情況下勾選 fill holes 選項；調(diào)大 spot separation 可以使連接的斑點分離；勾選 hair removal 可以去除頭發(fā)絲狀雜質(zhì)；調(diào)小 count area 可以去掉已經(jīng)選中的孔邊緣深色非斑點部分；勾選 normalize counts 可以根據(jù)斑點的平均分布估算紅圈外未選中區(qū)域的斑點個數(shù)，未勾選則完全刪除紅圈外的斑點個數(shù)，數(shù)字后會有一個 *，* 代表有估算的內(nèi)容在內(nèi)。

點擊 BACK，回到原來界面。

③ 設(shè)置閾值-gating

收集陽性孔斑點—collect POS Wells，點擊陽性孔，孔上會出現(xiàn) P 的標(biāo)記，然后點擊 finish。

收集陰性孔斑點—collect Neg Wells，點擊陰性孔，孔上會出現(xiàn) N 的標(biāo)記，然后點擊 finish。

點擊 auto-adjust，機器會自動設(shè)置閾值。如果陰性孔沒有斑點，直接在陽性孔上調(diào)節(jié)閾值。白色圓圈代表非特異性斑點，其大小在最小閾值以下。

點擊 start autocount，開始計數(shù)。

收集陽性孔斑點—collect POS Wells，點擊陽性孔，孔上會出現(xiàn) P 的標(biāo)記，然后點擊 finish。

收集陰性孔斑點—collect Neg Wells，點擊陰性孔，孔上會出現(xiàn) N 的標(biāo)記，然后點擊 finish。

點擊 auto-adjust，機器會自動設(shè)置閾值。如果陰性孔沒有斑點，直接在陽性孔上調(diào)節(jié)閾值。白色圓圈代表非特異性斑點，其大小在最小閾值以下。

點擊 start autocount，開始計數(shù)。

質(zhì)控

1. 點擊質(zhì)控—quality control。

2. 點擊 add plates，選擇添加板子后，觀察板子狀態(tài)，如果為計數(shù)，則狀態(tài)為 scan，如果已經(jīng)計過數(shù)，則狀態(tài)為 counted。

3. 點擊 start，開始質(zhì)控。

4. 處理有問題的孔，最好每個孔都看一遍。

5. 雙擊要處理的孔。

① 降低靈敏度，然后點擊 count，可以去除一些雜質(zhì)。

注意：調(diào)節(jié)靈敏度會使一些顏色較淺的信號斑點消失。

② 刪除斑點：高級設(shè)置 advanced setting—去除斑點 audit spots，然后點擊 count，雙擊選中的雜質(zhì)斑點，右擊選擇 YES 即可刪除雜質(zhì)斑點。刪除的斑點系統(tǒng)自動用黑色圓圈圈上。

③ 刪除區(qū)域：高級設(shè)置 advanced setting—手動模式 manual mode，然后點擊 count，這時可以畫圈選取不想要的區(qū)域，然后右擊閉合，即可選中。

點擊 manual mode 旁邊的 setting，可以在 manual 中選中 normalize，ignore 等選項，normalize 即選圈中的部分仍然技術(shù)，ignore 則為忽略不計數(shù)。

④ zero：適用于全部陰性孔，可全部刪除雜質(zhì)。

⑤ TNTC：too numerous to count，即斑點太多而無法計數(shù)，需要下次實驗調(diào)整細(xì)胞數(shù)目。

6. 點擊 finish to next plate 即完成一塊板子。

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文章來源：楊果

配圖來源：楊果

題圖來源：視覺中國

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