作者：張時民

單位：北京協(xié)和醫(yī)院檢驗科

尿液有形成分分析是尿液常規(guī)檢驗中的一項核心內(nèi)容，而自動化尿液有形成分分析儀的出現(xiàn)也有20多年的歷史了。除了進口品牌的流式尿液分析儀之外，還有眾多的圖像分析法儀器，也是國內(nèi)外應(yīng)用廣泛的設(shè)備。如果將影像法儀器細致劃分，還可分為流動型影像拍攝圖像系統(tǒng)和靜止型影像拍攝圖像式尿液分析系統(tǒng)（圖1）。

其實在靜止型影像式尿液分析系統(tǒng)中還可細分為染色法和非染色法儀器，本文則以目前所了解的染色法尿液有形成分分析系統(tǒng)為主，介紹其檢測原理及特點。據(jù)了解目前市場上主要有兩個品牌的儀器在國內(nèi)推廣和應(yīng)用，即日本東洋紡（TOYOBO）公司研發(fā)生產(chǎn)的UScanner檢測系統(tǒng)和中國深圳美僑醫(yī)療科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)檢測系統(tǒng)。本文作者就手邊掌握的資料著重就這兩個檢測系統(tǒng)進行介紹，給大家打開一個認識了解染色法尿液有形成分分析儀器的窗口。

影像法尿液有形成分分析系統(tǒng)在檢驗特點上主要是增加了一種染色劑，使得尿液中的有形成分以更加清晰、有特點的染色效果體現(xiàn)出來，使得在識別辨認上提高辨識度，當然也給計算機的運算和判定以及AI系統(tǒng)的應(yīng)用提出了新的挑戰(zhàn)。

一、USCANNER染色法尿液有形成分分析儀

是日本東洋紡公司生產(chǎn)的一款染色法尿液有形成分分析儀，并于2013年發(fā)布了USCANNERⅡ型儀器，在最近幾年則有新一代的USCANNER（E）型儀器和USCANNER premio型儀器在國內(nèi)外市場進行銷售。

1.檢測原理：系統(tǒng)構(gòu)成包括自動進樣系統(tǒng)、內(nèi)置顯微鏡系統(tǒng)、數(shù)字相機，染色液容器和管路、清洗劑及管路、一次性計數(shù)池、圖像分析軟件和操作系統(tǒng)軟件、廢棄計數(shù)板暫存容器等。

系統(tǒng)獨特之處在于對尿樣本進行活體染色，即新鮮尿標本與染色液混合，快速染色如如圖所示（圖2）。儀器先將染色液滴加到在計數(shù)板上的一個小池內(nèi)，再將混合均勻的尿液注入到這個小池中，混合染色，再吸取少許染色后的樣本轉(zhuǎn)移注入致計數(shù)板后面的計數(shù)池，經(jīng)過一段時間沉淀，數(shù)字顯微鏡系統(tǒng)可以拍攝多幅彩色數(shù)字圖像，軟件系統(tǒng)可以對圖像進行數(shù)字化分析，最終完成對圖像中有形成分的鑒別和計數(shù)。

該儀器采用的方法獨特之處是形態(tài)學(xué)原理及超活體染色法。一般圖像法分析原理的儀器多會對有形成分的大小、邊緣輪廓、紋理、細胞核有無、核大小、包漿和顆粒、投光性和色澤等諸多參數(shù)進行智能化分析。系統(tǒng)有獨特的測量尺，可對有形成分大小進行實際測量。該設(shè)備以彩色圖文的方式呈現(xiàn)最終檢驗結(jié)果。測定原理采用自主開發(fā)的程序，根據(jù)顯微鏡圖像分析進行分類和測量.標本被注入到專用的一次性計數(shù)版（T-PLATE）后，在顯微鏡下進行聚焦，被拍攝成數(shù)碼照片。軟件可以搜索到有形成分并聚焦畫面，通過軟件技術(shù)分離有拍攝到的形成分的照片，通過圖像處理后對圖像的形態(tài)發(fā)現(xiàn)和背景進行分離，根據(jù)被分離出的有形成分的特征，如有大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、細胞核、細胞質(zhì)、染色、透明度等多種參數(shù)進行分析（圖3），最后確定有形成分的屬性并進行輸出結(jié)果。分析結(jié)果可以選擇不同的報告方法，可以選擇每高倍視野（/HPF）或每微升（/μL）的方式，也可兩者同時使用。

2.染色方法：設(shè)備采用具有專利的改良S染色法。標準S染色法（Sternheimer Stain）是尿液檢驗中常用的活體染色法，一般適用于人工染色與鏡檢。染液中包含兩種物質(zhì)，即阿利新藍和派洛寧B。S染色是區(qū)別染色細胞質(zhì)的優(yōu)異方法，并且核以及核內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰可見，觀察未染色及染色，通過染色法可以區(qū)分難以識別的異形細胞（非典型細胞）。

改良S染色法為在原有配方的基礎(chǔ)上增加了適合儀器操作運行，特別是染色時間上控制的改進，同時配合數(shù)字圖像拍攝與識別效果，提高了尿液有形成分的辨識度。尿有形成分染色后可以明顯觀察到其內(nèi)部細微結(jié)構(gòu)，提高了尿液有形成分檢測的陽性率，各個有形成分相互間不會造成干擾，誤判率會降低。尤其可實現(xiàn)黑白圖像法無法做到的對尿液腫瘤細胞或特殊異型細胞的辨別，對臨床疾病的診斷辨別可提供更全面的檢驗結(jié)果。

3.可識成分：該設(shè)備在分析中有兩種判別類型：①可自動識別的成分：紅細胞、白細胞、上皮細胞、管型、細菌、結(jié)晶、酵母樣真菌、精子；②細致分類的項目：上皮細胞(鱗狀上皮細胞、尿路上皮細胞、腎小管上皮細胞)；管型(透明管型、顆粒管型、蠟樣管型)、紅細胞形態(tài)學(xué)報告等。下圖為該設(shè)備能夠識別的尿液有形成分典型圖案（圖4）。該設(shè)備具有測量尺功能，在辨別有形成分時可以測量其大小，輔助鑒別不明成分。

4.染色法的其他優(yōu)勢：通過改良 S 染色法，還可區(qū)分活體白細胞與死體白細胞，而尿液中白細胞的死活可為臨床提供尿路感染提供依據(jù)。染色法的一個特點是白細胞的活細胞往往不被染色液染色，而死亡的白細胞可被染色液染色。USCANNER（E）全自動尿有形成分分析儀應(yīng)用改良 S 染色法進行分析時，也可自動區(qū)分尿液白細胞的死活，可有效作為女性急性尿路感染的診斷依據(jù)（圖5）。此染色法還可發(fā)現(xiàn)疑似的尿路異型上皮細胞（圖6），這不僅是尿沉渣檢測儀器的一大進展，更重要的是得益于采用染色法原理的尿有形成分分析儀。

5.儀器其他性能參數(shù)：（1）檢測速度：100樣本／1小時。（2）樣本量：樣本用量112.5μL（但試管內(nèi)尿液量至少1mL），染色液添加約37.5μL。（3）儀器屏幕上可提供多幅鏡下染色的全視野彩色圖像（圖7），任意一幅圖像都可放大查看。（4）配套試劑：染色液，每包裝含600人份。（5）USCANNER專用清洗液，每包裝5L。（6）配套質(zhì)控品，QUSC‐700，USCANNER專用質(zhì)量管理用品（5mL×6只）。（7）可以通過橋接方式與尿液干化學(xué)分析儀銜接，形成流水線系統(tǒng)。目前在日本是與西門子全自動尿液分析儀連接，形成檢測流水線系統(tǒng)（圖8）。

二、Mejer-1800染色法尿液有形成分分析儀

此款儀器是中國深圳市美僑醫(yī)療科技有限公司于2018年推出的一款染色法尿液有形成分分析儀器，有可能是國內(nèi)最早生產(chǎn)靜止型影像拍攝圖像結(jié)合染色法的一款尿液分析儀器。該儀器首先使用SM染色法對樣本進行染色，然后再采用高清像素彩色相機拍攝彩色圖像，結(jié)合人工智能技術(shù)和深度學(xué)習(xí)技術(shù)，對尿液中的有形成分進行細致分析，將彩色圖像和檢測結(jié)果提供給用戶。

1.檢測原理：應(yīng)用形態(tài)學(xué)、模式識別（SVM）、AI（人工智能）深度學(xué)習(xí)、色度學(xué)四種軟件識別技術(shù)，對尿液中的有形成分進行細致分析和計數(shù)（圖9）。因為采用視覺成像技術(shù)，在圖像處理過程中對目標成分進行聚焦、對目標細胞坐標區(qū)域進行定位、目標區(qū)域分割、圖像識別等，都是依據(jù)細胞圖像輪廓、形態(tài)、色彩、紋理、平均灰度、圓形度、寬高比、平均投影、粗糙度、最大面積等諸多參數(shù)進行運算和處理。因為引入了染色技術(shù)，在圖像識別中特別增加了色彩的分析與判別，為形態(tài)學(xué)分析增加一個變量。

2.處理分析管型的技術(shù)要點：（1）對拍攝的原始彩色尿沉渣圖像采用色彩遷移法進行線性變換，降低不同樣本間原始圖像的背景色彩差異，最大化縮小同類別管型所含顏色的整體跨度，使同類別管型數(shù)據(jù)分布更加聚集；（2）采用形態(tài)學(xué)組合算法對色彩遷移后的圖像進行管型分割，初步篩選后得到管型候選子圖像；（3）對管型候選子圖像做旋轉(zhuǎn)、泊松融合等處理合成標準輸入圖像，并做歸一化處理；（4）將歸一化后的圖像數(shù)據(jù)輸入殘差神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

3.檢測流程：（1）將樣本混合均勻后，吸取一定量的標本。（2）取樣針吸取標本后先將標本滴入專用染色板內(nèi)進行染色。染色板是內(nèi)含SM染色劑的盒裝96孔染色板，每孔內(nèi)含一定量的染色液，僅可對一個尿液樣本進行SM染色。（3）標本染色后，取樣針吸取一定量的標本，通過樣本注入?yún)^(qū)充入到16孔的一次性計數(shù)版內(nèi)（圖10），排氣孔用于排出板內(nèi)氣體，可使標本充板均勻，不產(chǎn)生氣泡。該16孔計數(shù)板的獨特處是一批次最多可充入16個樣本。（4）將計數(shù)板自動推入到顯微鏡下，經(jīng)過一定時間的自然沉淀，使得有形成分盡可能沉淀下來，沉淀時間越長則效果越好。（5）首先采用低倍鏡掃描計數(shù)區(qū)，對較大目標（如上皮細胞，管型）進行拍攝、識別、分類和計數(shù)，對較小目標進行定位。如果尿液中有形成分濃度達到閾值后，儀器可運行自動稀釋模式，重新充入計數(shù)板，再沉淀，以達到準確識別和計數(shù)的目的。（6）自動轉(zhuǎn)換至高倍鏡，對較小的定位目標進行拍攝、識別、分類和計數(shù)。

4.染色方法：該儀器采用經(jīng)典的Sternheimer-Malbin（S-M）染色法，該染色方法在尿液檢驗中已經(jīng)使用多年。尿液中的有形成分經(jīng)兩種染料染色后，使得其形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，特別是對白細胞、各類管型的識別更加易于識別辨認。該儀器所用的染色液是預(yù)先貯藏于專用的96孔染色板內(nèi)，每板可進行96個尿液樣本的染色檢查（圖11）。S-M染色液的主要成分為龍膽紫和沙黃，經(jīng)過研究和改進，精心配置及過濾，適用于本自動化設(shè)備的染色應(yīng)用。

尿有形成分的圖像拍攝前先對尿液進行染色，整體染色前后對比效果較明顯。由于尿沉渣中不同類別細胞自身的生理特性，染液中的色素會不同程度的附著在細胞表面，形成的輪廓邊緣更加清晰，對比度更高。同時不同類別的細胞在色彩上也呈現(xiàn)出較大的差異，區(qū)分度更高。經(jīng)過染色后整體圖像對比度增強，細胞邊緣更加清晰，提高了聚焦的精度和識別的準確度。

尿中主要有形成分染色特點如下：①白細胞：嗜中性粒細胞染成紫色，細胞核染紫紅色（圖12）；②紅細胞基本不著色或淡紫色（圖13）；③管型：透明管型染成淡紅色或淺玫瑰色，顆粒管型染成淡紫色或者紫藍色（圖14），細胞管型染深紫色，蠟樣管型染紅紫色-深紫色；④上皮細胞：核染紫色-深紫色，胞質(zhì)染桃紅色-淡紫色，脂肪管型中的脂肪滴不著色；⑤細菌和真菌：存活及有活力的細菌染成粉紅色，死亡的細菌染成深紫色，酵母樣真菌不著色或淡紫色；⑥結(jié)晶不著色（圖15）。

但是不同病人的尿液樣本之間可因酸堿度、比重、顏色、粘稠度、細胞存活與死亡等多種因素影響，存在一定的差異，導(dǎo)致樣本染色后的圖像色差較大，不同尿液樣本中同類別的細胞呈現(xiàn)出的顏色跨度過大，導(dǎo)致不同類別的細胞之間色彩交叉重疊變大，使后期模型分類器在訓(xùn)練時出現(xiàn)無法收斂，或者過擬合現(xiàn)象。為了解決該問題，在預(yù)處理中使用色彩遷移算法對原始彩色圖像進行線性變換，降低了不同樣本間圖像的背景色彩差異，縮小了整體色彩跨度，使同類別的細胞數(shù)據(jù)分布更加聚集，相似度更高，提高了模型訓(xùn)練的收斂速度和分類精度。

5.可識別成分和圖像特點：包括紅細胞、白細胞、管型、上皮細胞、酵母菌、細菌、結(jié)晶、精子、粘液絲等39種尿液中的有形成分，部分有形成分和管型、結(jié)晶的亞類需人工輔助鑒別?？商峁┤曇皥D像（圖16）及分割視野圖像（圖17）?？勺杂蛇x擇查看低倍、高倍鏡下的全視野原圖以及經(jīng)過AI技術(shù)處理后分割并分類的單個細胞圖片，具有單個圖的追溯原圖的功能，可追溯到這些細胞在原圖中的位置和與周邊的關(guān)系，進行對比和人工再判斷，提高了復(fù)檢的便宜性。

最近有文章對該儀器的性能進行了初步評價[1]：儀器法與顯微鏡法的對比，BLD陽性符合率為95%，WBC陽性符合率為97%；攜帶污染率,紅細胞為0%，白細胞為0.01%；假陰性率紅細胞為2.3%，白細胞為0.5%，管型為0.9%，符合行業(yè)標準<3%的基本要求；穩(wěn)定性評價，8小時內(nèi)開機穩(wěn)定性CV<15%。

6.其他特點：（1）自動組合模式，可以同時橋接多臺沉渣和尿干化學(xué)檢驗設(shè)備，解決沉渣測試速度比尿干化學(xué)慢的問題，實現(xiàn)大批量快速測試。（2）尿干化學(xué)+尿有形成分結(jié)果可以實現(xiàn)同屏審核，數(shù)據(jù)可經(jīng)過LIS系統(tǒng)傳輸。可使用XX個/μl模式定量報告，可將尿干化學(xué)及有形成分以圖文報告模式進行打印。（3）可增添尿紅細胞直方圖功能，使用深度學(xué)習(xí)+形態(tài)學(xué)，對異常形態(tài)的紅細胞進行判別，提供紅細胞形態(tài)學(xué)位相分析及異樣紅細胞比率參數(shù)；直方圖可顯示紅細胞的直徑分布寬度、平均直徑、個數(shù)峰值比例、異常紅細胞比例、異常紅細胞個數(shù)等研究數(shù)據(jù)，這些內(nèi)容有助于輔助判斷血尿來源。（4）具有自動審核規(guī)則設(shè)置，實驗室可將經(jīng)實驗研究后確認的審核規(guī)則輸入系統(tǒng)，達到自動審核的目的，減少操作者工作強度，縮短TAT時間。（5）使用一次性計數(shù)板和染色板，減少交叉污染。一次性計數(shù)板設(shè)計獨特，使用鋼化玻璃面板，透光性強，平整度高，不會變形，有助于提高圖像質(zhì)量和清晰度。16孔設(shè)計的模式使得自然沉淀時間更加充分。（6）具有濃稠樣本自動稀釋功能，可自動利用染色板中剩余的樣本進行 5 :1自動稀釋重測，提升高濃度標本的檢測精度和準確度。

7.性能參數(shù)：（1）樣本量：最小樣本量2ml，吸樣量0.2ml。（2）檢測速度：根據(jù)樣本的復(fù)雜程度不同，其測試速度在90-150個標本/小時。（3）圖像大小：采用高清彩色圖像拍攝系統(tǒng)，實際圖像分辨率2048×1536dpi?？膳臄z多個全視野圖像。（4）區(qū)域：全視野掃描，陰性過篩，確保樣本不漏檢；采集圖像覆蓋區(qū)域達20μl，純圖像采集區(qū)域3.5μl；使用圖像計算區(qū)域2μl，檢測范圍寬，提高檢測靈敏度和檢出率；（5）配套耗材：①16孔一次性定量計數(shù)板；②盒裝96孔染色板；③濃縮清洗液。

三、其他設(shè)備

目前有研發(fā)單位在開發(fā)血液及體液細胞的數(shù)字切片圖像系統(tǒng)。所謂數(shù)字切片即是將血細胞或體液細胞涂在玻片上，應(yīng)用高分辨率數(shù)字相機對玻片進行低倍鏡，高倍鏡和油鏡下的全片掃描拍攝，形成一張完整的數(shù)字圖像片（類似于病理切片），這種圖像可以通過電腦軟件系統(tǒng)查看，在網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的支持下，可以在各地同時共覽，可用各種客戶端查看，可逐級放大，獲得清晰的細胞圖像。

在血液檢驗和骨髓檢驗上，這種系統(tǒng)已經(jīng)在使用，特別適合遠程會診、教學(xué)、考評和專題研究，在一些專題形態(tài)學(xué)討論會上已有使用。但應(yīng)用于尿液檢驗及體液檢驗的成熟設(shè)備還不多見。據(jù)了解某公司也在嘗試開發(fā)用于尿液形態(tài)學(xué)分析的此類設(shè)備。首先將尿標本離心，用沉淀物染色、涂片、干燥，然后用該設(shè)備進行全片掃描，拍攝低倍鏡、高倍鏡和油鏡下的圖像。目前該系統(tǒng)對固定標本的染色片處理較好，但對無法固定的濕片，因有形成分經(jīng)常移動位置，在全片掃描拍攝中還是有許多難度的。

審核及查看尿中的形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)，可通過網(wǎng)絡(luò)對拍攝的圖像進行查看，查看時首先觀察全片（圖19），選定一個區(qū)域后逐漸將目標放大，看清細胞結(jié)構(gòu)、輪廓、細胞核，管型的細節(jié)等等（圖20-21），還可使用內(nèi)置的測量尺測量其大小（圖22），協(xié)助對一些成分進行鑒別。目前雖然智能化識別判定只是僅僅開始，其識別判定能力會隨著大數(shù)據(jù)的增加和推進，將取得不斷的進展。

雖然該設(shè)備并沒有投入到常規(guī)實驗室的應(yīng)用，但作者認為其在教學(xué)，培訓(xùn)，科研，實驗室室間質(zhì)評工作中具有廣泛用途。尿液標本極難保存，而這些數(shù)字化的圖像是可以永久保存的，實驗室室間質(zhì)評不再僅僅是給你幾張圖片進行考核，而可能是讓你訪問網(wǎng)站，給你一個ID地址或二維碼，登錄之后在給你指定的編號的標本圖像中，查找和識別有形成分，并做出你的報告和判定。

總之尿液有形成分的數(shù)字化圖像技術(shù)的應(yīng)用，染色技術(shù)的應(yīng)用，人工智能技術(shù)的應(yīng)用將會不斷被推進，將在臨床檢驗、教育及質(zhì)量管理等方面取得更多的進展。

參考文獻

1.薛雄燕,李煒煊,彭超.Mejer全自動尿液分析流水線性能分析.臨床普外科電子雜志.2020年第4期。

注：本文來源于《臨床實驗室》雜志2021年第4期“臨床檢驗”專題