高效液相色譜法(HPLC)常用于檢查藥物的有關(guān)物質(zhì)，其計算方法有外標(biāo)法、帶校正因子的自控法、自控法和峰面積歸一化法。其中帶校正因子的自控法準(zhǔn)確，不需要每次都提供雜質(zhì)對照品，是目前常用的方法。這里簡要介紹校正系數(shù)的測量和校正系數(shù)準(zhǔn)確度的驗證。

一、修正系數(shù)的確定

校準(zhǔn)因子采用單點法、多點法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法和吸收系數(shù)比值法確定。很多文獻都報道了每種方法的基本操作和優(yōu)缺點，這里不再贅述。在確定校正系數(shù)時，邊肖建議使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，因為線性試驗是方法驗證的重要組成部分。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法不僅驗證了雜質(zhì)對照品和主成分的線性，而且獲得了準(zhǔn)確的校正因子，一舉兩得。

確定校正因子時，首先將各雜質(zhì)對照品和主成分對照品配制成一定濃度的原液，逐漸稀釋，直至找到各雜質(zhì)的定量限。線性范圍應(yīng)包括定量限濃度~限濃度的150%，主成分濃度范圍應(yīng)包括定量限濃度~自身對照濃度的150%。例如在有關(guān)物質(zhì)的測定中，供試品濃度為1mg/ml，采用0.1%的自身對照(即自身對照的濃度為1μg/ml)，雜質(zhì)A的限度為0.1%(即雜質(zhì)A的濃度限度為1μg/ml)。假設(shè)主成分和雜質(zhì)A的定量限均為20ng/ml，那么雜質(zhì)A和主成分應(yīng)在20 ng/ml ~以內(nèi)。繪制出各雜質(zhì)和主成分的線性曲線后，各雜質(zhì)和主成分之間的線性方程的斜率之比即為雜質(zhì)的校正系數(shù)。如果雜質(zhì)校正系數(shù)在0.9~1.1范圍內(nèi)，則直接采用自參比法，無需驗證。如果雜質(zhì)的校正系數(shù)在0.2~5.0之間，則需要有校正系數(shù)的自參方法。如果雜質(zhì)的校正系數(shù)小于0.2或大于5.0，雜質(zhì)的檢測波長可以改變并重新確定。如果所有測量值都在0.2~5.0之外，則表示添加了校正系數(shù)的自參考。

配制各種濃度的線性溶液時，一定要注意需要逐步稀釋。為了避免下面圖1所示的情況，我們應(yīng)該在圖2中顯示它，以確保各個點分布的均勻性。

圖1不正確的線性測試設(shè)計

圖2正確的線性測試設(shè)計

第二，相對校正系數(shù)和相對保留時間的持久性

當(dāng)使用帶有校正因子的自控方法進行定量時，通常通過相對保留時間來定位雜質(zhì)。此外，還研究了相對校正因子和相對保留時間的持久性。

具體考察方法與其他方法驗證的耐久性試驗相同，即改變波長、流速、柱溫、流動相比例、流動相pH值、使用不同品牌的色譜柱和儀器等。由各雜質(zhì)對照品和主成分制備混合對照溶液。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法繪制了雜質(zhì)對照品和主成分對照品在不同條件下的線性方程，并計算了校正因子。同時，計算了不同條件下雜質(zhì)對照品相對于主成分的相對保留時間。

至于相對校正因子，除了波長的變化，其他色譜條件的調(diào)整不會影響相對校正因子。因此，測定波長應(yīng)選擇在最大吸收或最小吸收的位置，而不是吸光度快速變化的位置。關(guān)于修正系數(shù)變化范圍的可接受范圍，目前尚無定論。邊肖認(rèn)為，如果最終標(biāo)準(zhǔn)中的相對修正系數(shù)只保留到小數(shù)點后一位，如0.7，則修正系數(shù)在所有情況下都控制在0.65~0.74的范圍內(nèi)，說明耐久性好。也就是說，采用有效數(shù)字的修訂規(guī)則，修訂值是標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的值。

對于相對保留時間，除了波長的變化，其他條件的變化都會對其產(chǎn)生影響。為了確保雜質(zhì)的準(zhǔn)確定位，必須研究相對保留時間的持久性。這里的測試不是為了證明相對保留時間的持久性，而是為了確定如何利用相對保留時間來定位雜質(zhì)。比如固定色譜柱的包裝和品牌，固定主峰的保留時間。至于RRT的可接受范圍，不能一概而論。如果雜質(zhì)譜復(fù)雜，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的RRT需要保留到小數(shù)點后兩位。如果雜質(zhì)譜比較簡單，雜質(zhì)之間的距離很遠，RRT可以保持到小數(shù)點后一位。在這里，我想和大家分享另一個經(jīng)驗，就是如果某些雜質(zhì)的相對保留時間不能固定，并且隨色譜參數(shù)的變化很明顯，可以定向破壞主成分，通過系統(tǒng)適用性試驗來定位雜質(zhì)。

第三，調(diào)查相對修正系數(shù)的準(zhǔn)確性

配制相同的供試品溶液，用自制法和帶校正因子的外標(biāo)法測定供試品中的雜質(zhì)含量。比較兩種方法的測定結(jié)果。校正系數(shù)與外標(biāo)法的負(fù)偏差不得超過0.05%，正偏差不得規(guī)定。如果試樣中檢測到的雜質(zhì)很少，可以向試樣中加入一定量的雜質(zhì)對照品進行測定。

此時，可以將相對校正因子固化到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，用帶校正因子的自控方法定量計算已知雜質(zhì)，既保證了定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，又簡化了試驗，節(jié)省了對照品的消耗。