PTSD(POST-TRAUMATICSTRESSDISORDISORDERDER)是一種以個(gè)人遭受重大創(chuàng)傷后發(fā)生的恐怖記憶閃回、噩夢(mèng)和警覺(jué)狀態(tài)為主要癥狀的精神疾病。

促進(jìn)恐懼記憶的消退是治療PTSD的有效途徑之一。暴露療法以條件性恐懼消退范式為基礎(chǔ)，在臨床PTSD患者的治療中取得了良好效果。

條件恐懼記憶的建立和消退過(guò)程都高度依賴于創(chuàng)傷產(chǎn)生的情景，海馬是進(jìn)行情景信息加工的重要腦區(qū)。研究表明在恐懼記憶的建立和消退過(guò)程伴隨著海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘的動(dòng)態(tài)重塑?？謶窒丝梢阅孓D(zhuǎn)由于條件性恐懼建立導(dǎo)致的樹(shù)突棘的增加。然而調(diào)節(jié)機(jī)制尚待闡明。

瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道(transientreceptorpotentialcanonical，TRPC)是TRP(transientreceptorpotential)基因超家族下的一個(gè)亞家族，主要包括TRPC1、TRPC2、TRPC3/6/7和TRPC4/5。由于大腦中與工作記憶有關(guān)的區(qū)域表現(xiàn)出持續(xù)的放電現(xiàn)象，而TRPC通道支持單個(gè)神經(jīng)元的持續(xù)放電，且改善工作記憶的神經(jīng)調(diào)質(zhì)受體往往也會(huì)激活TRPC通道，所以TRPC通道被認(rèn)為是構(gòu)成工作記憶的基礎(chǔ)之一，許多研究都報(bào)道了其亞型在學(xué)習(xí)記憶中的相關(guān)作用。例如NEUNER等的研究表明，干擾小鼠海馬TRPC3蛋白的表達(dá)可以提高小鼠在情景恐懼記憶范式測(cè)試階段的僵直行為百分比。TRPC6與TRPC3具有較高的序列相似性，且二者都可以被BDNF激活。

TRPC6編碼鈣可通透的非選擇性陽(yáng)離子通道，主要位于海馬神經(jīng)元的樹(shù)突棘部位。已有研究表明其可以正向調(diào)控海馬神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流并引起樹(shù)突棘的形成，進(jìn)而增強(qiáng)空間學(xué)習(xí)記憶能力，提示TRPC6對(duì)依賴于海馬的突觸結(jié)構(gòu)和記憶具有重要作用。然而TRPC6是否參與條件性恐懼記憶的建立和消退目前尚不清楚。因此，本研究采用腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的RNA干擾抑制海馬TRPC6的表達(dá)，探討TRPC6在情景條件恐懼記憶建立和恐懼消退中的作用，旨在為治療PTSD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性成年(6～8周)C57BL/6J小鼠，體質(zhì)量(22±2)g，購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由動(dòng)物房專人飼養(yǎng)，光/暗周期為12h/12h，自由覓食和飲水。操作均符合陸軍軍醫(yī)大學(xué)關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的管理和倫理規(guī)定。

圖片僅為插圖，不作參考

1.1.2主要儀器和試劑

SuperMaze動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)(XR-Xmaze，上海欣軟信息科技有限公司);曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)(XR-XZ301，上海欣軟信息科技有限公司);高架十字迷宮分析系統(tǒng)(XR-XG201，上海欣軟信息科技有限公司);SuperFcs條件性恐懼實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(XR-XC404，上海欣軟信息科技有限公司);TRPC6抑制腺相關(guān)病毒(AAV，干擾靶點(diǎn)序列為:5'-TCGAG-GACCAGCATACATG-3')及對(duì)照腺相關(guān)病毒(和元生物技術(shù)有限公司);兔抗TRPC6(編號(hào)ACC-017，美國(guó)AlomoneLab公司);小鼠抗β-actin(編號(hào)AA128，上海碧云天生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組

使用隨機(jī)數(shù)字表法將32只小鼠分為條件恐懼組和恐懼消退組，每組16只。條件恐懼組(立體定位注射后21d進(jìn)行條件恐懼的建立，22d進(jìn)行恐懼記憶的測(cè)試)分為空病毒對(duì)照組(Control)和病毒干擾組(sh-TRPC6)，每組8只;恐懼消退組(立體定位注射后4d進(jìn)行條件恐懼的建立，21d進(jìn)行條件恐懼消退訓(xùn)練，22d進(jìn)行消退記憶的測(cè)試)分為空病毒對(duì)照組(Control)和病毒干擾組(sh-TRPC6)，每組8只。

1.2.2動(dòng)物模型建立

在行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前24h將小鼠移至行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，以使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。情景性條件恐懼的建立參考HAIT等的方法:將小鼠放入條件恐懼箱，適應(yīng)150s后，給予5次不可逃避的足底電擊，2s)，每次電擊間隔58s，記錄適應(yīng)期和每次間隔期內(nèi)的僵直行為百分比(Freezing%)。情景性條件恐懼消退訓(xùn)練參考NAGAYOSHI等的方法:將小鼠放回條件恐懼箱，不施加任何刺激，進(jìn)行30min(共6試次，5min/試次)的恐懼消退，記錄每個(gè)試次內(nèi)的僵直行為百分比(Freezing%)。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由SuperFcs條件性恐懼實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄并自動(dòng)分析，小鼠僵直行為百分比超過(guò)50%即為建模成功。每只小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后送回動(dòng)物房，并用75%酒精清除試驗(yàn)箱內(nèi)殘留氣味。

1.2.3立體定位注射

腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠后，將其固定在小鼠腦立體定位儀上，充分暴露顱骨表面，以前囟點(diǎn)為零點(diǎn)，使用我們之前已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的坐標(biāo)(AP:－1.8mm，ML:+/－1.5mm，DV:－1.7mm)對(duì)小鼠兩側(cè)海馬CA1區(qū)分別進(jìn)行病毒注射，病毒滴度2.5×1012V.G./mL，每側(cè)注射0.9μL，注射速率0.2μL/min。對(duì)照組注射GFP標(biāo)記的空病毒(Control)，干擾組注射TRPC6的shRNA病毒(sh-TRPC6)，注射完成后留針5min再緩慢退針。

1.2.4AAV-TRPC6轉(zhuǎn)染位置的鑒定

腺相關(guān)病毒注射20d，取小鼠海馬切片經(jīng)PBS漂洗后用5%羊血清工作液室溫孵育30min，DAPI染核5min，PBS漂洗3次后封片，用激光共聚焦顯微鏡(Leica，Germany)觀察CA1區(qū)熒光表達(dá)并采集圖像。

1.2.5Westernblot檢測(cè)

深度麻醉小鼠后快速斷頭取腦，冰上分離海馬組織。1%PMSF(碧云天生物科技)及RIPA(碧云天生物科技)處理。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物科技)測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。室溫下5%脫脂奶TBST抗原封閉2h，加入特異性一抗TRPC6(1∶500)，4℃過(guò)夜。加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶2000，中杉金橋公司)37℃孵育1.5h后，ECL顯色。Image-ProPlu軟件對(duì)目的條帶的相對(duì)灰度值進(jìn)行量化分析。

1.2.6曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)試驗(yàn)箱為50cm×50cm×30cm醫(yī)用有機(jī)板材制成的無(wú)蓋盒狀箱。將小鼠放入試驗(yàn)箱中心區(qū)域，允許其自由探索5min。由配套的攝像頭和系統(tǒng)記錄并分析運(yùn)動(dòng)軌跡，計(jì)算其總移動(dòng)距離(cm)和外周/中心活動(dòng)度。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，XR-XZ301，上海欣軟

1.2.7高架十字迷宮

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)被廣泛用于嚙齒動(dòng)物焦慮水平的檢測(cè)，動(dòng)物在開(kāi)臂中停留時(shí)間的百分比和進(jìn)入開(kāi)臂的次數(shù)與焦慮程度呈負(fù)相關(guān)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)用于動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)情況的檢測(cè)。高架十字迷宮由2個(gè)開(kāi)臂(35cm×5cm×15cm)、2個(gè)閉臂(35cm×5cm×15cm)和中心區(qū)域(5cm×5cm)組成。將小鼠放入高架十字迷宮中心區(qū)域，允許其自由探索5min，由配套的攝像頭和系統(tǒng)記錄并分析運(yùn)動(dòng)軌跡，計(jì)算開(kāi)放臂滯留時(shí)間占總時(shí)間百分比(%)和進(jìn)出各臂次數(shù)總和。

高架十字迷宮，XR-XG201，上海欣軟

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以x珋±s表示，使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于條件恐懼建立和消退過(guò)程中的Freezing%變化趨勢(shì)，使用重復(fù)測(cè)量方差分析，其余檢測(cè)指標(biāo)均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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文章來(lái)源于第三軍醫(yī)大學(xué)田益沁、陳秀秀等老師發(fā)表的《TRPC6 在小鼠情景性條件恐懼記憶建立和消退中的作用》，分享于眾歡迎品嘗~