密切注意

轉(zhuǎn)基因三文魚已獲FDA批準(zhǔn)上市，成為全球首個獲準(zhǔn)直接食用的轉(zhuǎn)基因動物食品，開啟了轉(zhuǎn)基因動物商業(yè)化的大門。為了有效監(jiān)管轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品，世界各國都不同程度地制定了管理制度，包括安全性評價制度和轉(zhuǎn)基因成分識別管理制度。本文闡述了豬、牛、羊等轉(zhuǎn)基因動物的研發(fā)現(xiàn)狀及轉(zhuǎn)基因動物的檢測技術(shù)，并對世界主要國家/地區(qū)轉(zhuǎn)基因動物及其食品安全評價體系和轉(zhuǎn)基因成分鑒定體系的發(fā)展現(xiàn)狀進行了綜述。最后，對轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的發(fā)展進行了展望。

轉(zhuǎn)基因動物是指通過基因工程等技術(shù)對基因組進行改造，使其出現(xiàn)與原品種不同的性狀或產(chǎn)物。自1982年以來，美國科學(xué)家將生長激素基因引入小鼠受精卵獲得轉(zhuǎn)基因“超級小鼠”，為轉(zhuǎn)基因動物的研發(fā)打開了大門，先后培育出轉(zhuǎn)基因魚、兔、豬、牛、羊等20多種轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物廣泛應(yīng)用于提高生產(chǎn)性能、增強抗病能力、培育新品種、建立疾病模型、器官移植等方面。轉(zhuǎn)基因動物加工的產(chǎn)品稱為轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品。目前，世界上轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的主要管理體系是安全評價和標(biāo)簽管理體系。轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的生物安全性已經(jīng)引起了全世界研究機構(gòu)和組織的關(guān)注。在進入人們的生活之前，都經(jīng)過了嚴(yán)格的安全性評價。同時，為了保護消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)，各國根據(jù)本國國情制定了轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)簽管理制度。同時，轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的檢測技術(shù)是保證安全評價和標(biāo)簽管理制度順利實施的重要手段。

一、轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品概述

1.轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的研究概況

轉(zhuǎn)基因動物的研究主要集中在提高生長率、建立疾病模擬、增強抗性和改變表型上。近年來，學(xué)者們開發(fā)了具有顯性癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠、酪氨酸酶雙等位基因豬和Park 2、PINK1敲除豬等。，為腫瘤、動脈粥樣硬化、白化病、帕金森綜合征和乙型肝炎等疾病建立了模型，也為一氧化氮合酶和eGFP相關(guān)染色質(zhì)的功能研究提供了新思路。MSTN基因敲除豬和表達(dá)外源纖維素酶和木質(zhì)素酶的轉(zhuǎn)基因小鼠的成功開發(fā)，為提高動物的瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率奠定了基礎(chǔ)。雙shRNA表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因牛、短發(fā)夾RNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因雞等轉(zhuǎn)基因動物可以有效防止疾病的傳播。為了增加動物的觀賞價值，帶有綠色熒光蛋白基因的豬、帶有黃色熒光蛋白基因的斑馬和帶有紅色熒光蛋白基因的唐魚相繼出現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因牛的研發(fā)主要集中在乳腺生物反應(yīng)器上，如含人乳鐵蛋白基因的牛和含人血清白蛋白基因的牛。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的學(xué)者們先后開發(fā)了含有人乳鐵蛋白、人溶菌酶和人α-乳清蛋白基因的轉(zhuǎn)基因奶牛。近日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)者報道，利用轉(zhuǎn)基因小鼠的唾液腺作為生物反應(yīng)器成功生產(chǎn)人神經(jīng)生長因子蛋白，標(biāo)志著基于轉(zhuǎn)基因動物唾液腺生物反應(yīng)器制備人蛋白藥物的首次成功。

在轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化方面，2015年，通過轉(zhuǎn)移太平洋奇努克鮭魚生長激素基因啟動子和海洋鱈魚ⅲ型抗凍蛋白基因獲得的轉(zhuǎn)基因鮭魚分別獲得美國和加拿大的批準(zhǔn)，成為首個獲準(zhǔn)上市的轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品，將為轉(zhuǎn)基因動物的商業(yè)化起到示范作用。同時，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的三種新藥已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)，包括轉(zhuǎn)基因雞生產(chǎn)的ATryn、轉(zhuǎn)基因兔生產(chǎn)的Ruconest和轉(zhuǎn)基因雞生產(chǎn)的Kanuma。在申請轉(zhuǎn)基因三文魚商業(yè)化幾十年的同時，幾只轉(zhuǎn)基因動物也提交了商業(yè)化申請。為了防止轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品在研究、試驗、生產(chǎn)、加工和管理過程中的傳播和污染，制定轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的安全評價和標(biāo)簽管理制度并發(fā)布相應(yīng)的細(xì)則已成為一種趨勢。

2.轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品檢測技術(shù)研究綜述

近年來，轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品獲得了快速發(fā)展。然而，由于不同國家和地區(qū)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的閾值范圍和標(biāo)記方法的差異，快速準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)成為各國研究的重點，對進出口檢疫結(jié)果的相互認(rèn)可和消除貿(mào)易壁壘具有重要作用。目前，轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的檢測主要從核酸和蛋白質(zhì)兩個層面進行。

基于核酸水平的檢測技術(shù)主要包括定性聚合酶鏈反應(yīng)、定量聚合酶鏈反應(yīng)、多重聚合酶鏈反應(yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)和基因芯片。Sekhavat等人利用phiC31整合酶系統(tǒng)評價了體細(xì)胞核移植(SC-NT)和精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(SMGT)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因牛胚胎的效率，并通過聚合酶鏈反應(yīng)和測序驗證了靶向位點的準(zhǔn)確性。張等研究了三重轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠(3xTg-AD小鼠)的行為能力，通過定量PCR發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠miR-34a基因的表達(dá)明顯低于非轉(zhuǎn)基因小鼠。馬鑫等人設(shè)計了小鼠基因組內(nèi)參考基因的賴氨酸基因、新霉素抗性基因、轉(zhuǎn)基因啟動子和特異性引物，建立了轉(zhuǎn)基因小鼠的多重聚合酶鏈反應(yīng)方法。陶等建立了-1轉(zhuǎn)基因豬的LAMP方法，檢測限為1。26納克/微升..翟等人建立了特異性檢測HLTF/HLAlB轉(zhuǎn)基因牛的LAMP方法，可檢測至少10個拷貝的靶分子。李全芬針對8個選定的基因開發(fā)了基因芯片方法，檢測限為1 pg。

基于蛋白質(zhì)水平的檢測技術(shù)主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡檢測、免疫層析試條和免疫組織化學(xué)。Donyavi等人成功地獲得了用人白細(xì)胞介素-12 (hil-12)轉(zhuǎn)化的利什曼原蟲，并通過ELISA成功地檢測了重組hil-12，其濃度為(246。53±15.92)pg ml-1。Dang Keiko等用免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡法檢測姜黃素給藥后APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1區(qū)AKT和P-Akt表達(dá)的變化。我單位研制了檢測轉(zhuǎn)基因乳中人乳鐵蛋白的夾心ELISA和雙抗體夾心膠體金試紙條，檢測轉(zhuǎn)基因乳中人乳清白蛋白的夾心ELISA。目前，轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品檢測技術(shù)的發(fā)展落后于轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展速度。我們應(yīng)該借鑒轉(zhuǎn)基因植物的檢測技術(shù)，發(fā)展數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)和生物傳感器技術(shù)，為轉(zhuǎn)基因安全管理和鑒定管理的順利實施提供有力的技術(shù)支持。

二、轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的安全性評價體系

各國政府通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全評價體系對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行管理，決定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品能否進入市場甚至商業(yè)化。轉(zhuǎn)基因動物安全評價以實質(zhì)平等為主要原則，包括案例分析、預(yù)防、逐步深化、科學(xué)依據(jù)、公開透明等原則。實質(zhì)平等是指轉(zhuǎn)基因動物或其食品與傳統(tǒng)物種或食品在安全性上沒有區(qū)別。目前，國際安全評估基于食品法典委員會(CAC)標(biāo)準(zhǔn)，并以CAC/GL68-2008《對使用重組DNA動物生產(chǎn)的食品進行食品安全評估的指南》為指導(dǎo)。我國主要根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》對轉(zhuǎn)基因動物的安全性進行評價，政府專門成立了國家轉(zhuǎn)基因動物安全評價委員會，負(fù)責(zé)對申報的轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品進行審查。

1.轉(zhuǎn)基因動物健康狀況評估

一般情況下，應(yīng)以非轉(zhuǎn)基因動物的健康指標(biāo)作為參考，主要評價有:1)一般健康特征，包括行為、生長、發(fā)育、解剖、生殖功能等。；2)生理生化指標(biāo)，包括臨床和分析參數(shù)；3)其他轉(zhuǎn)基因動物的特異性指標(biāo)。

2.敏化評價

在轉(zhuǎn)基因動物的最終食物中，需要評估新表達(dá)的蛋白質(zhì)是否會引起過敏反應(yīng)或可能對某些人產(chǎn)生過敏反應(yīng)。主要評價:1)蛋白質(zhì)來源；2)氨基酸序列同源性；3)血清篩查試驗；4)模擬胃腸液的消化；5)實驗動物模型試驗。

值得注意的是，過敏食物在生活中很常見，如牛奶、雞蛋、豆制品、堅果等。這些食物可能會對一些人產(chǎn)生過敏反應(yīng)，但對大多數(shù)人來說是安全的。

3.毒理學(xué)評價

毒理學(xué)評價包括表達(dá)產(chǎn)品和全食品。1)對表達(dá)產(chǎn)物進行毒理學(xué)評價，通常比較新表達(dá)蛋白的核酸和氨基酸序列，進行熱穩(wěn)定性試驗和模擬胃腸消化試驗，探討其耐熱性和抗消化能力。2)全食品最常用的毒理學(xué)評價方法是動物試驗，這也是應(yīng)用于人類食品前的必要手段，常采用90 d亞慢性毒性試驗。如果亞慢性毒性試驗表明可能對健康有不良影響，則應(yīng)進行長期慢性試驗，包括急性毒性試驗、遺傳毒性試驗(Ames試驗)、精子畸形、骨髓微核、致畸試驗、亞慢性毒性試驗和慢性毒性試驗。在一些轉(zhuǎn)基因食品中，慢性毒性試驗可以省略。

4.關(guān)鍵部件的成分分析

在相同條件下飼養(yǎng)非轉(zhuǎn)基因動物時，轉(zhuǎn)基因動物食物中典型成分的含量和傳統(tǒng)食物等效成分的變異參數(shù)應(yīng)在自然變異范圍內(nèi)。

5.營養(yǎng)評估

當(dāng)轉(zhuǎn)基因動物被外源基因轉(zhuǎn)移時，其食物的營養(yǎng)價值可能會發(fā)生一定程度的變化，因此有必要對轉(zhuǎn)基因食物的營養(yǎng)進行評估。轉(zhuǎn)基因食品的營養(yǎng)評價主要集中在食品的蛋白質(zhì)、淀粉和氨基酸方面。

6.儲存和加工的確定

重點關(guān)注食品加工(包括家庭食品準(zhǔn)備)對轉(zhuǎn)基因動物產(chǎn)品的潛在影響。如果基因改造的目的是改變貯藏性狀，則應(yīng)評估改造對食品安全和營養(yǎng)質(zhì)量的影響。

7.意外效果評估

基因插入、敲除或重組導(dǎo)致的動物傳統(tǒng)育種帶來的意想不到的效果，可能是好的，也可能是壞的，也可能是中性的。一些轉(zhuǎn)基因動物的某些特性可能導(dǎo)致獸藥殘留、重金屬積累、腸道菌群變化、基因轉(zhuǎn)移等。在評價中，也要注意這種變化。

目前，研究人員已經(jīng)對轉(zhuǎn)基因動物的安全性進行了評估。鮑等人采用傳統(tǒng)方法和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測了轉(zhuǎn)基因羊和非轉(zhuǎn)基因羊腸道中大腸桿菌、沙門氏菌、雙歧桿菌、糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的數(shù)量。兩種方法都表明tlr4基因的表達(dá)不影響綿羊腸道微生物的數(shù)量。鮑等人研究了山羊生長激素是否只在轉(zhuǎn)基因山羊乳腺中表達(dá)，并通過PCR檢測腸道、糞便和周圍土壤中GH和標(biāo)記基因neoR，但未發(fā)現(xiàn)水平基因轉(zhuǎn)移。同時，采用聚合酶鏈反應(yīng)變性梯度凝膠電泳和16S rDNA測序檢測腸道、糞便和周圍土壤中的微生物群落，發(fā)現(xiàn)它們與非轉(zhuǎn)基因山羊之間沒有明顯差異。周等分析了BN大鼠轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白奶粉中rHLF蛋白的致敏性，發(fā)現(xiàn)對BN大鼠的IgE、IgG、IgG2a和嗜酸性粒細(xì)胞無明顯影響，證明該蛋白對動物的致敏性較弱。徐攀等分析了FSHa/b轉(zhuǎn)基因公豬F1代公豬的生長曲線、血液生理參數(shù)、血清生化參數(shù)、器官重量和組織病理學(xué)。結(jié)果表明，除精囊重量外，它們與半同胞非轉(zhuǎn)基因公豬無顯著差異。16S rRNA基因測序表明，f 1代腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化，外源基因在交配母豬、轉(zhuǎn)基因豬腸道微生物、轉(zhuǎn)基因豬場土壤微生物和蚯蚓體內(nèi)沒有產(chǎn)生水平基因轉(zhuǎn)移。

三、標(biāo)識管理系統(tǒng)

不同國家對轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)簽的態(tài)度不同，根據(jù)國情制定了相應(yīng)的標(biāo)簽管理制度(見表1)。一般來說，國際標(biāo)記管理系統(tǒng)主要分為兩類，即自愿標(biāo)記和強制標(biāo)記。根據(jù)標(biāo)注范圍的不同，強制標(biāo)注可以分為全面強制標(biāo)注和部分強制標(biāo)注，即目錄標(biāo)注。全面強制標(biāo)簽是指只要轉(zhuǎn)基因成分含量超過閾值，食品就必須貼標(biāo)簽。

1.自愿鑒定

在加拿大、阿根廷、香港、南非和菲律賓，轉(zhuǎn)基因食品的管理采用“實質(zhì)平等”的原則，即已被認(rèn)定的轉(zhuǎn)基因食品與傳統(tǒng)食品沒有區(qū)別，一般不強制添加特殊標(biāo)簽。只有當(dāng)食品安全發(fā)生變化時，如過敏、成分、營養(yǎng)等，才需要特殊鑒別。

2.強制識別

1)美國

美國是世界上轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展最快的國家，轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽的管理分為兩個階段。第一階段是2016年之前，實行自愿貼標(biāo)簽政策。美國政府認(rèn)為，只要轉(zhuǎn)基因食品通過審核，本質(zhì)上就等同于傳統(tǒng)食品的安全性，不需要強制標(biāo)注。第二階段始于2016年7月29日，美國公布了《國家生物工程食品披露標(biāo)準(zhǔn)》，重新確立了對含有轉(zhuǎn)基因成分的食品進行標(biāo)簽標(biāo)注的基調(diào)。自2011年9月以來，食品安全中心向FDA提交了一份關(guān)于“轉(zhuǎn)基因食品強制標(biāo)簽”的請愿書。之后各州相繼提出自己的法律。佛蒙特州于2014年5月通過了《轉(zhuǎn)基因食品強制標(biāo)簽法案》，成為第一個頒布轉(zhuǎn)基因食品強制標(biāo)簽法的州。2016年7月29日，美國公布了《生物工程食品披露國家標(biāo)準(zhǔn)》，結(jié)束了長達(dá)五年的標(biāo)簽戰(zhàn)。新法規(guī)定，含有轉(zhuǎn)基因成分的食品，應(yīng)當(dāng)以下列任何一種方式強制標(biāo)注:文字、轉(zhuǎn)基因成分說明或者與產(chǎn)品成分鏈接的二維碼，并明確規(guī)定飼喂轉(zhuǎn)基因飼料的動物無需標(biāo)注。然而，需要鑒定的轉(zhuǎn)基因成分的閾值尚未明確。作為世界上最大的轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)國和消費國，美國對轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)簽態(tài)度的改變將對世界轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)簽?zāi)Ｊ疆a(chǎn)生巨大影響。

2)歐盟

歐洲對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實行以流程為基礎(chǔ)的全面強制性標(biāo)簽制度，即只要原料中含有轉(zhuǎn)基因成分，最終產(chǎn)品是否能檢測出來就要進行標(biāo)簽。歐盟根據(jù)“消費者知情權(quán)”原則和“風(fēng)險防范原則”，對轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)簽進行管理。1990年4月，歐洲議會發(fā)布了《轉(zhuǎn)基因生物向環(huán)境釋放指令》(90/220/EEC指令)，首次提出了對轉(zhuǎn)基因生物進行標(biāo)識的要求，為歐盟轉(zhuǎn)基因食品的管理奠定了基調(diào)。1990年后，歐盟廢除并修訂了法律法規(guī)，擴大了轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽的范圍。轉(zhuǎn)基因的標(biāo)簽閾值設(shè)定為1%，最終產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因物質(zhì)的含量小于1%，可以免除標(biāo)簽，增加可追溯性要求。由于歐盟對轉(zhuǎn)基因食品的嚴(yán)格要求，以及與美國等轉(zhuǎn)基因主要生產(chǎn)國的貿(mào)易爭端不斷升級，在壓力下，歐盟于2003年制定了新的法規(guī)，建立了全新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品跟蹤系統(tǒng)，以確保批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因生物及其食品和動物飼料能夠從生產(chǎn)到流通進行跟蹤，增加了企業(yè)在其中的作用；同時，識別閾值從1%提高到0。9%.如果轉(zhuǎn)基因成分來自未經(jīng)歐盟批準(zhǔn)上市的轉(zhuǎn)基因品種，只有當(dāng)轉(zhuǎn)基因物質(zhì)的含量小于0時，才能免除標(biāo)簽。被歐洲食品安全管理局認(rèn)為沒有風(fēng)險后的5%。

3.中國

中國是世界上唯一實施定性標(biāo)簽的強制性標(biāo)簽國家。目前，中國主要根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進口安全管理辦法》、《轉(zhuǎn)基因食品衛(wèi)生管理辦法》和《中華人民共和國食品安全法》(以下簡稱《食品法》)對轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)簽進行管理，主要包括5大類17種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。不允許按規(guī)定銷售或進口無標(biāo)識或無標(biāo)識的食品，2015年新修訂的《食品安全法》首次將轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)識提升到法律層面，明確指出轉(zhuǎn)基因食品的生產(chǎn)和銷售要按規(guī)定“顯著標(biāo)識”。

四.前景

轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品作為新的生物，可能有潛在的風(fēng)險，但風(fēng)險與機遇并存。在我們意識到風(fēng)險的同時，我們也應(yīng)該意識到它們帶來的機會，我們不應(yīng)該因為風(fēng)險而停滯不前，這將導(dǎo)致與其他國家的差距擴大。轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品進入食物鏈前經(jīng)過嚴(yán)格的生物安全評價，商業(yè)化后按照相應(yīng)的標(biāo)簽管理制度進行標(biāo)簽。消費者可以根據(jù)標(biāo)識選擇是否食用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。我國政府應(yīng)充分發(fā)揮公信力，盡快制定實施細(xì)則和條例，同時聯(lián)合各大媒體和高校普及宣傳轉(zhuǎn)基因知識，避免妖魔化轉(zhuǎn)基因。所有研究人員都應(yīng)繼續(xù)走轉(zhuǎn)基因動物的研究和產(chǎn)業(yè)化道路，促進轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品的開發(fā)和推廣。

作者:中國檢驗檢疫研究院動物檢疫研究所

轉(zhuǎn)載來源:畜牧獸醫(yī)，2019年第51卷第2期