最近有個(gè)實(shí)習(xí)生來(lái)實(shí)驗(yàn)室，X哥給她安排了一個(gè)構(gòu)建慢病毒過(guò)表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)。

今天早上她告訴我昨晚做的大腸桿菌擴(kuò)增質(zhì)粒的培養(yǎng)液今天早上還是很清晰的。我問(wèn)她培養(yǎng)液加了什么抗生素。她說(shuō)是卡那霉素單硫酸酯，我給她看了之前的一篇文章。

她恍然大悟。剛到實(shí)驗(yàn)室的小白大部分人不知道抗生素的用法和作用原理。今天X濕哥給大家介紹一下。

一個(gè)

抗生素的作用原理

第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的自然是著名的青霉素，它在二戰(zhàn)期間拯救了無(wú)數(shù)生命。

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)室研究的細(xì)胞大多是原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。為了獨(dú)立研究某些類(lèi)型的細(xì)胞，有必要抑制其他類(lèi)型細(xì)胞的增殖。比如在升高293T時(shí)加入青霉素/鏈霉素，可以抑制潛在原核細(xì)菌的增殖，但不影響293T的功能。

真菌分泌并抑制細(xì)菌

抗生素的作用機(jī)制是什么？這首先要了解細(xì)胞生命活動(dòng)的本質(zhì)。如果細(xì)菌或細(xì)胞想要存活，它需要以下條件才能正常進(jìn)行:

DNA復(fù)制:在DNA聚合酶的作用下，DNA本身被復(fù)制，每個(gè)細(xì)胞在有絲分裂時(shí)都有一套DNA；

轉(zhuǎn)錄和RNA形成過(guò)程:在RNA聚合酶的催化下，用DNA模板鏈合成RNA，產(chǎn)生mRNA的過(guò)程；；

翻譯和蛋白質(zhì)合成過(guò)程:mRNA在核糖體中作為模板，tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸、合成肽或蛋白質(zhì)；

細(xì)胞膜完整性:細(xì)胞膜是阻止細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞的屏障，保證了細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定性，使各種生化反應(yīng)有序進(jìn)行。

細(xì)胞壁的完整性:原核單細(xì)胞生物需要有細(xì)胞壁，細(xì)胞壁位于細(xì)菌細(xì)胞的最外層，包圍著細(xì)胞膜，以保持細(xì)胞的正常形態(tài)，避免因機(jī)械力和滲透壓失衡而破裂。

摧毀任何一個(gè)環(huán)節(jié)，細(xì)胞都會(huì)死亡！死定了！

2

實(shí)驗(yàn)中漏掉了抗生素？

(1)抑制RNA轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制:抑制核酸的功能阻止細(xì)胞分裂和/或所需酶的合成，抗生素包括Zeocin、利福平等

(2)干擾蛋白質(zhì)合成:干擾蛋白質(zhì)合成中核糖體的正常組裝，例如競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合大小亞基?？股匕ㄋ沫h(huán)素、鏈霉素、氯霉素(用于提高質(zhì)粒產(chǎn)量)、新霉素、慶大霉素、卡那霉素和嘌呤霉素。

基因霉素(G418)抑制真核細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成

(3)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu):一些抗生素與細(xì)胞膜相互作用，影響細(xì)胞膜的通透性，對(duì)細(xì)胞有致命的影響。這樣作用的抗生素是多粘菌素和短桿菌。

(4)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成:抑制細(xì)胞壁合成會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞破裂和死亡。抗生素的特點(diǎn)是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，包括氨芐青霉素和卡霉素。哺乳動(dòng)物細(xì)胞如293T和CHO沒(méi)有細(xì)胞壁，不受這些藥物的影響。

三

抗生素對(duì)于真核原核生物是不一樣的！

因?yàn)樵思?xì)胞和真核細(xì)胞的一些分子合成特性不同，以蛋白質(zhì)合成過(guò)程為例。

原核生物，其核糖體為70S，由30S和50S亞基組成。真核細(xì)胞，核糖體是80S，由40S和60S亞基組成。四環(huán)素和鏈霉素主要與細(xì)菌核糖體的30S亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。

氯霉素、紅霉素、青霉素、卡那霉素只能特異性作用于原核生物的核糖體。

白喉毒素和環(huán)己酰亞胺只作用于真核生物的核糖體；

潮霉素、嘌呤霉素(結(jié)構(gòu)類(lèi)似于tRNA分子末端)和蓖麻毒素可以抑制原核生物和真核生物的核糖體。

四

質(zhì)粒的抗性基因是什么？

很多質(zhì)粒有AmpR、PuroR、KanR、TetR等，稱(chēng)為抗性基因。

有的童鞋會(huì)問(wèn)，我在擴(kuò)增和包裝質(zhì)粒的時(shí)候，為什么要在培養(yǎng)基中添加抗生素？為什么質(zhì)粒有抗性基因？

因?yàn)橘|(zhì)粒不是細(xì)胞的必需元素，甚至可以說(shuō)是負(fù)擔(dān)。質(zhì)粒在沒(méi)有抗生素的培養(yǎng)基中增殖時(shí)逐漸被消除。只有當(dāng)抗生素被添加到培養(yǎng)基中，并且抗性基因賦予宿主細(xì)菌分解抗生素的能力時(shí)，細(xì)胞才會(huì)保留質(zhì)粒。

就像平時(shí)，不需要武器，但是戰(zhàn)場(chǎng)上你要拔槍射敵人才能自保。這種質(zhì)粒相當(dāng)于一把機(jī)關(guān)槍?zhuān)o細(xì)胞在抗生素環(huán)境中生存的條件。這樣我們研究的功能基因就可以存在于每個(gè)細(xì)胞中。

關(guān)注后，獲得《科研實(shí)踐手冊(cè)》1.0、2.0、3.0、4.0和基金文章的最佳收藏