隨著人們生活水平的不斷提高，食品、醫(yī)藥、飲料、化妝品等行業(yè)都需要進(jìn)行微生物檢測(cè)。在微生物檢測(cè)中，每個(gè)人都需要了解微生物菌群的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定和保存。今天小姐姐為大家準(zhǔn)備了相關(guān)內(nèi)容，希望對(duì)你的檢測(cè)工作有所幫助。

微生物的純培養(yǎng)和分離技術(shù)

獲得純培養(yǎng)物對(duì)微生物學(xué)研究非常重要。

純培養(yǎng)是指來源于同一單細(xì)胞的細(xì)胞群。

圖片來源:CICC

菌株的分離和純化

從混合微生物群體中僅獲得一種或一種微生物菌株的過程稱為微生物分離和純化。在分子生物學(xué)的研究和應(yīng)用中，不僅要通過分離純化技術(shù)從混合的天然微生物群落中分離出特定的微生物，還要保持微生物的純培養(yǎng)“純”，防止其他微生物混入。

平板涂布法

由于微生物懸液是先加入到滾燙的培養(yǎng)基中，然后倒在平板上，很容易造成一些熱敏性細(xì)菌的死亡，而稀釋倒平板法由于固定在瓊脂中的氧氣不足，也會(huì)影響一些嚴(yán)格的需氧細(xì)菌的生長(zhǎng)，所以微生物學(xué)研究中常用的純分離法是包被平板法。

用途:一般用于從菌種中提純；

優(yōu)點(diǎn):可觀察菌落特征，分離混合菌；

缺點(diǎn):不能算；

條紋平板法

分離微生物最簡(jiǎn)單的方法是平板劃線法，其原理是將固體培養(yǎng)基表面的微生物樣品從點(diǎn)到線多次稀釋，達(dá)到分離的目的。劃線方法有很多，其中常見的容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有對(duì)角線法、曲線法、正方形網(wǎng)格法、輻射法、四格法等。

用途:一般用于篩選菌株。一般用來統(tǒng)計(jì)平板培養(yǎng)基的回收率。

優(yōu)點(diǎn):可以計(jì)數(shù)觀察菌落特征。

缺點(diǎn):吸收少，麻煩多，干燥效果差，容易擴(kuò)散。如果菌液密度高，就不會(huì)長(zhǎng)出單個(gè)菌落。

大腸桿菌的培養(yǎng)和鑒定

大腸桿菌能在乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，產(chǎn)生氣體和酸，使培養(yǎng)基變色。它也可以在曙紅亞甲藍(lán)的固體培養(yǎng)物上生長(zhǎng)，形成深紫色的菌落，其中一些具有金屬光澤。其他致病菌的菌落是粉紅色的。鏡檢為無芽孢革蘭陰性桿菌(紅色)。大腸菌群的存在是可以鑒定的。

文化保存

細(xì)菌保存是指在不污染其他雜菌的情況下，對(duì)微生物菌種進(jìn)行長(zhǎng)期保存，并保持其形態(tài)特征和生理特性，減少變異，防止老化，以方便以后使用。菌種的保存一般是選擇其休眠休，如孢子；孢子等。，并產(chǎn)生低溫；烘干；缺氧；避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境條件有利于休眠體的長(zhǎng)期休眠。對(duì)于不產(chǎn)芽孢的微生物，其代謝應(yīng)該處于最低狀態(tài)，不會(huì)死亡，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。

實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

注意:

1.乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基:由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫、膽鹽組成，屬于液體、鑒定、增量、半合成培養(yǎng)基，用于實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)廢水中的菌群；

2.曙紅-亞甲藍(lán)瓊脂:含有蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、曙紅-亞甲藍(lán)和瓊脂。瓊脂平板用于分離純化腸道致病菌，尤其是大腸菌群和糞大腸菌群；

3.營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:含牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂。用于分離純化菌體培養(yǎng)物。

實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.實(shí)驗(yàn)安排

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備；

取樣、恒溫培養(yǎng)富集和初篩；

觀察產(chǎn)氣情況，稀釋，倒入培養(yǎng)基，劃線，涂布并倒置培養(yǎng)物；

鑒定和接種；

菌種保存。

2.具體操作步驟

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

①準(zhǔn)備培養(yǎng)基(曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基:7.4g+200mL無菌水，調(diào)至pH 7.2 ~ 7.4，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:6.6g+200mL無菌水，調(diào)至pH 7.4±0.2，0.85%生理鹽水，乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基2.6g+100mL無菌水，調(diào)至pH 7.4±0.2)。

(2)包扎培養(yǎng)皿、移液管、試管，進(jìn)行干熱滅菌。

③將配制好的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基放入三個(gè)試管中，每個(gè)試管約10毫升，包扎，滅菌。

(4)對(duì)液體石蠟和涂桿等實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿進(jìn)行滅菌。

取樣和培養(yǎng)

取2 ~ 3滴左右的水、湖水、廢水，放入3個(gè)滅菌的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基試管中，貼上標(biāo)簽(采樣時(shí)間、人員、溫度、采樣地點(diǎn)、天氣情況)，塞好棉條，放入恒溫箱(37℃)中培養(yǎng)18 ~ 24小時(shí)；

觀察氣體產(chǎn)生和稀釋

(1)觀察產(chǎn)氣管中是否有氣柱，并標(biāo)記陽(yáng)性管的數(shù)量。

②樣品稀釋:

對(duì)5個(gè)滅菌試管進(jìn)行編號(hào)(分別為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)和5號(hào))。從樣品溶液試管中取出1毫升樣品溶液，放入含9毫升生理鹽水的試管中，作為1號(hào)試管。更換移液管，按照上述方法依次制備5份10倍系列稀釋液。貼一個(gè)清晰的標(biāo)簽。

劃線和涂層

(1)涂布平板法:

將融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌平板中，制成無菌平板。冷卻凝固后，將一定量的含大腸菌群的污水滴在平板表面，然后用無菌玻璃涂布棒將菌液均勻分散在平板的整個(gè)表面，置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，選擇單個(gè)菌落。

※涂層板法操作:

1.將涂抹器浸入裝有酒精的燒杯中；

2.取少量菌液(不超過0.1毫升)，滴在培養(yǎng)基表面；

3.點(diǎn)燃火焰上沾有少量酒精的涂抹器，待酒精燃盡后冷卻8 ~ 10s；

4.用涂布機(jī)將菌液均勻涂布在培養(yǎng)基表面。包衣時(shí)，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使包衣均勻。

注意:

1.將涂抹器的末端浸入含有70%酒精的燒杯中。取出時(shí)，讓多余的酒精完全滴在燒杯中，然后用少量酒精在火焰上點(diǎn)燃涂抹器。

2.操作時(shí)注意防火！不要將過熱的涂抹器放在裝有酒精的燒杯中，以免點(diǎn)燃其中的酒精。)

②號(hào)牌方法:

培養(yǎng)后挑出單個(gè)菌落，用無菌操作將少量菌落浸入接種環(huán)中，在無菌曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板表面連續(xù)劃線。微生物細(xì)胞的數(shù)量會(huì)隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐漸分散。如果裸奔合適，微生物可以一個(gè)個(gè)散開。37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，在平板表面可獲得單個(gè)菌落。(有時(shí)，這些單個(gè)菌落并不是全部由單個(gè)細(xì)胞繁殖，所以必須反復(fù)分離才能獲得純種。)

平板劃線操作:

證明是確實(shí)的

觀察EMB平板，菌落為紫黑色，有或稍有金屬光澤，或淺紫紅色，只有中心顏色較暗，選擇符合上述特征的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡檢查(油鏡)觀察是否為無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。

培養(yǎng)

A.將菌落轉(zhuǎn)移到裝有玻璃珠的無菌錐形瓶中，調(diào)節(jié)酸堿度至7，搖勻備用。

b、液體發(fā)酵:將1毫升處理后的樣品溶液加入滅菌后的乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基中。搖勻后在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)

文化保存

(1)斜面冷凍保存法:

這是最常用的方法。一般模具；放線菌和有孢子的細(xì)菌可保存2 ~ 4個(gè)月，酵母菌可保存2個(gè)月，無孢子的細(xì)菌每周移植一次。操作流程如下:

A.接種:將待保存的菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，在試管上貼上標(biāo)簽，記下菌種名稱和時(shí)間。

B.培養(yǎng):根據(jù)所需的溫度和時(shí)間培養(yǎng)各種細(xì)菌。

c、保存:選擇生長(zhǎng)旺盛的菌株，用衛(wèi)生棉條將它們用無菌塑料包裹在試管上部，防止衛(wèi)生棉條感染雜菌。儲(chǔ)存在4℃的冰箱中。

(2)液體石蠟的儲(chǔ)存方法:

這種方法可以用不能分解石蠟的細(xì)菌保存。保存時(shí)間為六個(gè)月至一年。放線菌；霉菌和產(chǎn)芽孢細(xì)菌可以保存兩年。液體石蠟可以防止培養(yǎng)基中水的蒸發(fā)，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。同時(shí)可以防止氧氣進(jìn)入，防止好氧菌的生長(zhǎng)。從而延長(zhǎng)菌種的保存時(shí)間。但需要注意的是，試管必須直立放置，不方便攜帶。操作流程如下

a .液體石蠟的滅菌:將液體石蠟放入錐形瓶中，其體積不得超過錐形瓶體積的1/3，用棉塞塞住，然后用高壓蒸汽滅菌兩次(120℃，30分鐘)。然后在110-120℃烘箱中蒸發(fā)蒸汽滅菌帶來的水分..此時(shí)石蠟透明清澈。檢驗(yàn)后確定無菌。

b菌種培養(yǎng):待所需菌種培養(yǎng)完畢后，選擇健康菌種進(jìn)行保存。

c .加入石蠟油:用無菌管吸取石蠟油，加入菌種試管，最好比菌種斜面頂點(diǎn)高1cm。較少，培養(yǎng)基會(huì)暴露在油表面，使培養(yǎng)基干燥，造成細(xì)菌死亡。

d采集:試管上部用塑料包裹，垂直立于4℃冰箱內(nèi)。

e恢復(fù):當(dāng)使用菌株時(shí)。倒出石蠟油。這種石蠟油可以消毒和重復(fù)使用。接種培養(yǎng)。因?yàn)榧?xì)菌外面有油。第一次細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，性狀恢復(fù)不是很好。所以需要再次移植才能獲得好的品系。

總結(jié)

此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的記錄應(yīng)包括:

1.觀察并記錄乳糖膽鹽培養(yǎng)基的產(chǎn)氣情況。

2.在EMB培養(yǎng)基上觀察菌落(包括上述實(shí)驗(yàn)方案中規(guī)定的形狀、質(zhì)地和顏色。)

3.記錄顯微鏡檢查結(jié)果。

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