細胞凋亡，也稱為程序性細胞死亡(PCD)，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自己的程序，結(jié)束自己生命的過程。這是一個活躍的、高度有序的、基因控制的過程，涉及一系列酶。細胞凋亡的概念提出至今還不到30年。但由于其在保證多細胞生物健康生存中起著關(guān)鍵作用，在病理學(xué)研究中對個體的正常發(fā)育和細胞凋亡的紊亂起著重要作用，人們對其機制和成分進行了廣泛深入的研究，成為目前生命科學(xué)界最熱門的話題之一，也是生命科學(xué)界乃至各行各業(yè)爭相投資的研究領(lǐng)域。從近年來的SCI排名可以看出，關(guān)于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的文章遠遠超過了關(guān)于人類第二基因組的文章，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個重要前沿領(lǐng)域是細胞凋亡的研究。隨著該領(lǐng)域研究的不斷升溫，出現(xiàn)了大量檢測細胞凋亡的新技術(shù)和新方法，其中許多已經(jīng)商業(yè)化，大大加快了研究進程。具體而言，對于凋亡的不同階段，有以下方法:

1.早期檢測:

1)細胞外膜上PS(磷脂酰絲氨酸)的檢測:

PS從細胞膜內(nèi)部向外部的轉(zhuǎn)移發(fā)生在凋亡誘導(dǎo)后不久，

它可以用作免疫系統(tǒng)的識別標記。AnnexinV是一種鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白，可以特異性結(jié)合暴露在膜外的PS，然后通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。因為這是凋亡早期的活細胞檢測(懸浮細胞和貼壁細胞都適用)，所以可以結(jié)合DNA染色或其他晚期檢測方法來標記凋亡的發(fā)展階段。

位于美國加州的BioVision是世界領(lǐng)先的細胞凋亡和細胞信號研究公司。其產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)價廉，包裝使用方便。生物視覺為膜聯(lián)蛋白提供多種標簽

v產(chǎn)品，并有完整的早期凋亡檢測試劑盒，配有核染料PI。

本德醫(yī)療系統(tǒng)公司擁有安納西

V專利，可提供各種規(guī)格的Annexin V凋亡檢測試劑盒。Annexin V FITC試劑盒含有Annexin

v和核染料PI，小包裝，適合檢測小樣品的客戶。

此外，Biovision公司和德國美天尼公司提供磁珠來包被Annexin

v、凋亡細胞可以通過磁分選進行篩選。

2)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)變化的檢測:

在正常情況下，谷胱甘肽是細胞的重要氧化還原緩沖劑。細胞內(nèi)的有毒氧化物通過GSH還原作用周期性去除，氧化的GSH可以被GSH還原酶快速還原。這種反應(yīng)在線粒體中尤為重要，呼吸作用中許多副產(chǎn)物的氧化損傷將被清除。在Jurcat和一些其他類型的細胞中，細胞膜上存在ATP依賴的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，該系統(tǒng)可由凋亡信號啟動。當(dāng)細胞內(nèi)GSH清除非?；钴S時，細胞液由還原環(huán)境變?yōu)檠趸h(huán)境，可能導(dǎo)致細胞凋亡早期線粒體膜電位下降，從而將細胞色素C(三羧酸循環(huán)的重要成分)從線粒體轉(zhuǎn)移到細胞液中，啟動凋亡效應(yīng)子caspase的級聯(lián)反應(yīng)。

因為

谷胱甘肽與氧化還原和線粒體功能密切相關(guān)。這種檢測不僅對研究細胞凋亡的起始非常有用，而且對心臟病、中風(fēng)和其他疾病的治療也非常有用。但是有些細胞，比如HeLa

3T3細胞在凋亡過程中谷胱甘肽水平無明顯變化，不能用該方法檢測。

3)細胞色素C的定位和檢測

細胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細胞凋亡中起著重要作用。在正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的空腔中，凋亡信號刺激其從線粒體釋放到細胞液中并與Apaf-1結(jié)合

(凋亡蛋白酶激活

因子-1):細胞色素C/Apaf-1復(fù)合物激活半胱天冬酶-9，半胱天冬酶-9又激活半胱天冬酶-3和其他下游半胱天冬酶。

細胞色素c氧化酶亞單位ⅳ(細胞色素c氧化酶

亞單位ⅳ:COX 4)是一種位于線粒體內(nèi)膜的膜蛋白。當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時，它保留在線粒體中，因此它是線粒體富集的一個非常有用的標記。細胞色素C

凋亡檢測試劑盒能有效檢測細胞凋亡過程中細胞色素c的釋放。

4)線粒體膜電位變化的檢測:

在細胞凋亡研究的早期，從形態(tài)學(xué)觀察線粒體沒有明顯變化。隨著對凋亡機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是凋亡的重要組成部分，并發(fā)生了許多生理生化變化。如凋亡誘導(dǎo)后線粒體跨膜電位發(fā)生變化，導(dǎo)致膜通透性改變。一種陽離子染色劑，對這種變化非常敏感，并顯示不同的熒光染色。在正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，并發(fā)出強烈的紅色熒光。在凋亡細胞中，由于線粒體跨膜電位的改變，以單體形式存在于細胞液中，發(fā)出綠色熒光。這兩種不同的熒光信號可以通過熒光顯微鏡或流式細胞術(shù)清晰區(qū)分。來自Biovision的有絲分裂原

線粒體凋亡檢測

試劑盒(線粒體凋亡檢測試劑盒)可以簡單、靈敏地分析和檢測體外凋亡過程中線粒體的變化。

2.

延遲檢測:

在細胞凋亡的后期，核酸內(nèi)切酶(某些胱天蛋白酶的底物)切割核小體之間的細胞核DNA，產(chǎn)生大量長度為180-200的DNA

bp的一個DNA片段。

1)凋亡DNA階梯檢測試劑盒

細胞處理后，用常規(guī)方法分離純化DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙錠染色。在凋亡細胞群中可以觀察到典型的DNA階梯?？焖俚蛲龌?/p>

梯形檢測試劑盒可以快速(約1-2小時)靈敏地檢測凋亡細胞中的DNA片段。

2)基于TUNEL的DNA片段分析試劑盒

在細胞凋亡中，

染色體DNA的雙鏈斷裂或單鏈斷裂產(chǎn)生大量粘性3’-羥基末端。在脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下，脫氧核苷酸與熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物可以被標記到DNA的3’端，從而可以檢測到凋亡細胞。Apo-BrdUTM分析采用兩種顏色的TUNEL法通過流式細胞術(shù)檢測凋亡細胞中的DNA條帶。所采用的BrdU比生物素標記或地高辛酰化的方法更敏感。新添加的ApoBrdU-IHCTM是一個完整的雙色免疫組織化學(xué)(IHC)檢測DNA片段的試劑盒。Apo-DIRECTTM是一種非常簡單的用于流式細胞分析的凋亡細胞一步標記法。

3)胱天蛋白酶分析試劑和試劑盒

Caspase在細胞凋亡中起重要作用，屬于天冬氨酸蛋白酶。Caspase-3是關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在許多凋亡信號通路中起作用。在正常條件下，半胱天冬酶家族以無活性酶原(30 ~ 50 kD)的形式表達，由原始結(jié)構(gòu)域、大亞基(~20kD)組成

)和小亞基(~ ~10kD

).當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時，半胱天冬酶可被蛋白酶裂解，大小亞單位形成活化的半胱天冬酶。經(jīng)過一些半胱天冬酶的激活，可以激活其他半胱天冬酶，形成半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)，促進細胞凋亡。