核酸雜交簡史；

技術原理基礎知識:

1、核酸的結構:

一級結構:核苷酸序列

穩(wěn)定鍵:磷酸二酯鍵

二級結構:雙螺旋結構

穩(wěn)定鍵:氫鍵、堿基堆積力、疏水鍵

高級結構:染色體

一級結構和二級結構

高級結構

2.核酸變性:

變性:在某些物理化學因素的作用下，維持DNA分子二級結構的氫鍵和堿基堆積力被破壞，DNA由雙螺旋變?yōu)閱捂湣?/p>

化學鍵的變化:維持雙螺旋斷裂穩(wěn)定性的氫鍵和疏水鍵，可以是部分或完全的，可逆的或不可逆的

化學結構變化:DNA變性改變了它的空內部結構，不涉及其一級結構的變化

3.核酸的復性:

是指變性DNA的兩條互補鏈在適當條件下完全或部分恢復到天然雙螺旋結構的現(xiàn)象，是變性的反向過程。

4.退火:

一般熱變性DNA緩冷后可以重折疊，這叫退火。雙鏈DNA、RNA雙鏈區(qū)、DNA、RNA雜交雙鏈等異源雙鏈核酸分子都具有這種性質。

5.核酸分子雜交

根據(jù)堿基互補原理將兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈結合成異質雙鏈的過程稱為分子雜交或核酸分子雜交。

雜交的本質是在一定條件下對互補的核酸鏈進行復性

高級技術原理知識ⅰ

1.核酸探針的類型

核酸探針是指能夠與特定核苷酸序列特異性互補雜交，并能在雜交后通過特殊方法檢測的已知標記核酸分子。

2.選擇探頭的最基本原則

非常具體

探頭的來源方便嗎

探針準備困難

核酸探針的類型

脫氧核糖核酸探針

核糖核酸探針

寡核苷酸探針

3.探針長度

脫氧核糖核酸和核糖核酸探針

DNA探針通常有400~500個堿基。如果探針長度超過1500個堿基，雜交的背景會很高。DNA探針的長度可以在探針標記的過程中進行調整。DNA探針的長度可以通過改變間隙翻譯中酶與底物的比例以及隨機引物標記中引物與DNA模板的比例來調節(jié)。與DNA探針相比，RNA探針的長度不是那么容易控制的。在RNA探針標記過程中，RNA探針的長度實際上取決于將重組DNA分子線性化的限制性酶位點。

寡核苷酸探針

作為探針，它必須有足夠的長度與目標序列特異性雜交。如果探針太短，它會與靶序列中的多個位點雜交，降低特異性。探針的最小長度取決于其目標序列的復雜性。哺乳動物基因組約為3×109bp，因此探針長度不應短于17個核苷酸。與基因組DNA相比，mRNA和c DNA的復雜度更低，因為它們是由基因組DNA序列不完全轉錄形成的，所以檢測cDNA文庫靶序列的探針可以更短。

4.核酸探針的標記

理想的探針標記應具有以下特征:

分析物應靈敏、特異、穩(wěn)定且簡單

標記物和探針結合后，雜交反應，特別是雜交特異性、穩(wěn)定性和Tm值不應受到影響

該標記物對環(huán)境污染小，對人體無傷害，價格低廉

該標記不干擾檢測方法

放射性同位素標記

Gap翻譯法隨機引物法

DNA探針的末端標記

單向體外轉錄制備RNA探針

非放射性同位素標記

酶標記的核酸探針

高碘酸鈉法原理:由于HRP是一種與糖結合的酶，高碘酸鈉可以將糖中的羥基氧化成醛基，然后與抗體連接，再加入硼氫化鈉還原成穩(wěn)定的酶偶聯(lián)物。

生物素標記的核酸探針

5.標記探針的檢測

放射性標記探針檢測

放射自顯影術——根據(jù)放射性核素釋放的能量使相紙感光的原理

直接放射自顯影術

在暗室中，將含有放射性雜化分子的膠片緊貼在x光膠片上，放入暗盒中。放射性核素衰減會釋放出β射線照相膠片上的銀粒子，產生穩(wěn)定的潛像。膠片沖洗后，會產生一個可見的圖像。圖像的位置與雜化分子在膠片上的位置一致，圖像的深度反映了雜化分子的含量。

間接放射自顯影術

為了增加32P的檢測靈敏度，X射線膠片被夾在增感屏和膠片之間。增感屏是一種覆蓋有鎢酸鈣等閃爍體的彈性塑料片，受激發(fā)時會發(fā)光。32P的射線穿透X射線膠片照射到增感屏上，激發(fā)增感屏上的物質發(fā)光，其射線能使X射線膠片感光并產生潛像。

放射自顯影攝影膠片的選擇

所用放射性核素的輻射必須是可探測的

滿足測試靈敏度和清晰度的要求

使用直接或間接放射自顯影術

增感屏發(fā)出的光的波長

膠片顯影方法

非放射性探針檢測

非放射性探針檢測示意圖

酶促顯色檢測

直接檢測:酶本身作為標記分子摻入核酸，洗脫后可直接檢測。

酶直接作用于生色或化學發(fā)光底物，導致顏色沉淀或發(fā)光。顯色沉淀可以用肉眼檢測，而發(fā)光檢測依賴于對藍光敏感的x光片。常用的紫外和可見光光源有汞燈、氬氪激光和氦氖激光。熒光素發(fā)射的熒光波長的光源可用于熒光探針雜交的直接檢測。

堿性磷酸酶顯色體系:AKP可以作用于其底物BCIP去磷聚合，過程中釋放H+還原NBT形成不溶性紫色化合物二甲基吡啶，從而使與標記探針雜交的靶位可見。

間接檢測:檢測地高辛、生物素或熒光素標記的探針時，需要加入一個將酶連接到雜交核酸分子的步驟。最簡單的是同時加入鏈霉親和素和HRP，使生物素化的雜交分子與酶形成連接，然后加入合適的底物。

熒光檢測

熒光素是一種在激發(fā)光作用下能發(fā)出熒光的物質，包括異硫氰酸熒光素、羥基香豆素、羅丹明等。熒光素與核苷酸結合后可作為探針標記，主要用于原位雜交。

化學發(fā)光檢測

化學發(fā)光:化學反應釋放的能量以光的形式發(fā)射，一些底物被AKP水解會發(fā)光，從而形成檢測信號。發(fā)射光的強度反映了酶的活性，進一步反映了雜化分子的數(shù)量。增強化學發(fā)光:辣根過氧化物酶將魯米諾水解為3-氨基鄰苯二甲酸酯，并在428nm處發(fā)出熒光。但這種情況下如果存在特殊化合物，發(fā)出的光強度會增加到1000倍，使得發(fā)出的光更容易被探測到，增強了反射的靈敏度。

多探針檢測

使用多種探針，每種探針用不同的報告基團如生物素、熒光素和地高辛標記，同時與固定在膜上的核酸分子雜交，并通過使用不同的鏈霉親和素或抗體-酶和相應底物的組合與不同的雜交分子顯色。

高級技術原理知識ⅱ

1、核酸分子雜交的類型

分子雜交:樣品核酸變性處理，在低溫條件下，加入標記的核酸探針，探針與樣品的互補序列形成雜交雙鏈，通過展示標記或其他方法檢測特定的核酸片段。根據(jù)雜交的反應條件，可分為固相雜交和液相雜交兩種類型:

2.分子雜交技術的一般過程

探針的制備和標記

待測核酸樣品的制備

雜交

雜交后處理

顯示結果

結果分析

3.核酸分子雜交技術的類型

反向點雜交

用于基因分型檢測，如人類白細胞抗原分型、人類乳頭瘤病毒基因分型、丙型肝炎病毒分型等。

基因突變檢測:如中國人β地中海貧血基因突變檢測、苯丙氨酸羥化酶基因突變引起的苯丙酮尿癥檢測、結核分枝桿菌rpob基因高突變區(qū)耐藥基因檢測、乙型肝炎病毒突變檢測等。

Southern印跡

可用于單基因遺傳病的基因診斷，如鐮狀細胞性貧血。

基因點突變的檢測:如ATP敏感鉀通道亞單位和內向整流鉀通道基因A635G的檢測。

北方印跡

用于RNA病毒檢測，如丙型肝炎病毒檢測。

基因表達的檢測:例如，研究乳腺癌細胞中過表達的基因。

原位混合法

原位雜交技術不僅具有核酸分子雜交特異性高的特點，而且能夠準確定位，因此該技術已廣泛應用于醫(yī)學分子生物學的研究，其應用包括以下幾個方面:

-正?；虍惓Ｈ旧w的基因定位。

-核酸探針和細胞內RNA之間的雜交用于檢測組織細胞中特定基因的表達水平。

-將組織和細胞與作為探針的特定病原體核酸雜交，以檢測病原體的感染。

4.雜交的影響因素

主要有探針選擇、探針標記方法、探針濃度、雜交速率、雜交最適溫度、雜交嚴格度、雜交反應時間和雜交促進劑。