RNAi(RNA干擾)是雙鏈RNA高效特異誘導同源RNA降解的現(xiàn)象。使用siRNA進行基因沉默因其操作方便而受到研究者的歡迎，并且它也已經成為分子生物學應用中最常用的基因下調工具。

然而，設計siRNA的第一步是選擇siRNA目標。你知道目標設計中所有的注意點嗎，比如同源區(qū)域設計，blast比較？

今天，吉凱基因致力于SiRNA設計的教學，一步步教你設計siRNA！(如需視頻連接，請聯(lián)系我們。)

SiRNA的設計原則

1.選擇目標序列

序列特點：19~21個堿基GC含量適中：35%-55%避免出現(xiàn)超過4個連續(xù)的A或T盡量設計在CDS區(qū)序列位置分布均勻

2.分析目標特異性

默認針對同源區(qū)設計與非目的基因連續(xù)匹配的堿基數(shù)不超過15bp

RNAi作用機制

SiRNA設計方法

1.美國國家生物技術信息中心

從NCBI獲得關鍵信息:基因標識，基因庫標識，轉錄本之間的同源性。

在NCBI主頁的基因界面輸入“基因名稱”和“物種”，搜索相應的基因。

基因界面顯示多種信息:

下拉到“基因組區(qū)域、反式和產物”，可以看到Genbank ID的轉錄物信息(共15個轉錄物)，對應于序列，可以在核酸界面查詢。Genbank ID的命名規(guī)則如下:

NM,XM--編碼類型轉錄本（NM為認證的，XM屬于預測的）；NC,NG,AC等—基因組類型；NR,XR—非編碼轉錄本（NR表示認證的，XR表示預測的）；AK、AF等命名—看注釋，大部分為文章的作者提交的序列。

對應于基因庫編號的水平線表示前體核糖核酸的垂直正方形表示外顯子的輕正方形表示UTR

暗方塊表示編碼區(qū)域中每個基因庫標識的公共方塊是同源區(qū)域

選擇轉錄較短、同源外顯子數(shù)量最多的轉錄本作為設計靶，其位于同源區(qū)的概率較高(例如TP53基因NM_001276697和NM_001126115，它們只是外顯子1序列在非同源區(qū)的一部分)。

2.Invitrogen RNAi設計師設計

打開Invitrogen網(wǎng)站，選擇“siRNA”，在步驟1輸入Genbank ID或核酸序列，在步驟2輸入默認編碼區(qū)；選擇無爆炸；在步驟3中；步驟4 GC內容默認；Step5位數(shù)設計原理，默認可以使用。點擊“RNAi設計”。

以設計NM_001276697為例，網(wǎng)站默認給出十個目標及對應信息。Rank星多的目標是高分，Tuschl的模式也是一種目標計分方法。答>:B& gt；C>。d的分數(shù)排名，這兩項在選擇目標時可以綜合參考。

通用電氣法界

GE Dharmacon是一家提供siRNA服務的專業(yè)公司，其設計網(wǎng)站具有一鍵同源區(qū)域設計功能，流程如下:

打開法界網(wǎng)站。第一步，有三種信息需要填寫，即核酸序列(序列以fasta格式輸入，以大于命名，序列填寫在另一行)、基因號和基因庫號。

步驟1:選擇標識符類型

以TP53的基因ID為例，輸入7157獲得NCBI的轉錄本信息，同源區(qū)設計通過三個參數(shù)進行調整(截圖部分):

“必需的”是指靶向對應的轉錄本(如果兩者都是必需的，那么它是針對同源區(qū)域的)

“許可”是指相應的抄本可能是也可能不是目標

“排除”作為目標不針對相應的轉錄本(可以滿足針對不同轉錄本設計特定目標的需要)

步驟2-4的參數(shù)與Invitrogen的參數(shù)相同，根據(jù)要求選擇:

點擊“設計siRNA”。從高到低打分，根據(jù)Access的Genbank ID在對應位置搜索序列(網(wǎng)站設計默認目標為19bp)?？焖傩蛄兴阉饕娨曨lsnapgene。

BLAST對齊

每個設計網(wǎng)站blast使用的底層數(shù)據(jù)庫是不同的(NCBI數(shù)據(jù)總是更新的，不同時期存在不同的數(shù)據(jù)版本，網(wǎng)站blast數(shù)據(jù)庫不一定實時更新)，導致不同的blast結果。因此，在設計中，我們放棄了網(wǎng)站本身的blast選項，直接將目標與NBCI-blast進行對比。打開BLAST網(wǎng)站:

填寫核酸序列，選擇比對數(shù)據(jù)庫，點擊“blast”。人和老鼠都有快速的選擇。如果是其他物種，點擊“其他”，默認為“nr/nt”，輸入指定的物種。下面給出了三種說明:

挪威鼠(滑行編號:10116)

房屋鼠標(taxid:10090)

智人(taxi id:9606)

在結果界面，Max Score列值除以2表示匹配的堿基數(shù)；TP53基因的15個轉錄本全部完全匹配，所以目標位于同源區(qū)；其次，不完全靶的Max Score為30.2，即實際上與SIPA1L2結合了15個堿基，有4個錯配，符合特異性原理，這個靶的blast結果還可以。

以上是目標設計和對比的過程。這種方法也適用于非編碼RNA。選擇多個網(wǎng)站設計的共同目標，設計2~3個目標進行驗證，更有利于篩選有效目標。你學過今天的目標設計嗎？！

SiRNA設計和使用的網(wǎng)站和網(wǎng)址(可點擊鏈接)

NCBI基因查詢

NCBI核酸序列查詢

Invitrogen網(wǎng)站

通用電氣法界

NCBI爆炸

Snapgene軟件下載

陳建儒，吉凱基因工具病毒產品售前技術專家；從事載體構建5年以上，熟悉各種核酸數(shù)據(jù)庫及核酸相關分子設計和預測；我在基因操作軟件和網(wǎng)站上錄制了很多課程，被用戶一致評價為“極其實用易學”！

接下來，陳先生接下來的課程將與您見面。如果對課程感興趣，想進一步交流，請加個微信號(13162396225)得到陳老師的1V1指導~ ~

1.怎么找到基因序列？

2.怎么設計引物？

3.RNAi/CRISPR靶怎么設計？

4.如何預測miRNA靶基因/miRNA結合位點？

5.如何預測轉錄激活因子的結合位點？

非編碼RNA是國家自然科學基金的研究熱點，吉凱基因將于6月27日(周四)15:30直播，這次千萬不要錯過！

非編碼RNA:國家自然科學基金的研究熱點

網(wǎng)絡課程第三期開始了！