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生物工藝干貨

連續(xù)生產(chǎn)已經(jīng)在食品和化工生產(chǎn)中應(yīng)用多年，由于其高效、快速和更加穩(wěn)定的特點，近年來越來越受到制藥行業(yè)的重視。FDA一直倡導(dǎo)并鼓勵制藥公司應(yīng)用更有效的制藥工藝，包括鼓勵制藥公司將連續(xù)生產(chǎn)作為提高治療效果的有效途徑之一。邊肖無能，我想分幾期和朋友討論一下連續(xù)生物技術(shù)。今天，我給你這個系列的第一篇文章:

一個

主題:上游工藝灌注介質(zhì)的選擇

灌注培養(yǎng)概述

隨著單克隆抗體藥物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們通過不斷改進設(shè)備和生產(chǎn)工藝來提高單克隆抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前，傳統(tǒng)的補料分批培養(yǎng)在工業(yè)生產(chǎn)中仍占主導(dǎo)地位，而對于一些不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或?qū)Ξa(chǎn)品質(zhì)量有特殊要求的蛋白質(zhì)，灌注培養(yǎng)有利于保持產(chǎn)品質(zhì)量。灌注培養(yǎng)通過增加細(xì)胞密度和優(yōu)化培養(yǎng)環(huán)境，可以提高產(chǎn)品產(chǎn)量，減小設(shè)備尺寸，提高單位體積產(chǎn)量。

灌注培養(yǎng)模式

早期灌注培養(yǎng)主要應(yīng)用于貼壁細(xì)胞，包括培養(yǎng)基空纖維膜生物反應(yīng)器和固定床(Disc)。

目前在單克隆抗體和重組蛋白的生產(chǎn)中，主要采用懸浮細(xì)胞的灌注培養(yǎng)，利用高效的截留設(shè)備可以大大提高細(xì)胞密度。介質(zhì)空纖維系統(tǒng)甚至可以同時具有澄清過濾或超濾功能。主要的攔截系統(tǒng)有超聲波攔截、TFF攔截、ATF攔截。

超聲波截取裝置的末端是開放的(圖1)，依靠超聲波截取所有細(xì)胞。理論上可以無限培養(yǎng)，國內(nèi)已經(jīng)有300多例了。

圖1生物傳感器圖2 TFF圖3自動變速箱油

TFF(切向流過濾，圖2)和ATF(交替切向流，圖3)是介質(zhì)空纖維系統(tǒng)的示意圖。中空纖維體系可使密度提高到2× 10 8個/ml以上，表達量可達50g/L以上..

灌注介質(zhì)的選擇

在灌注培養(yǎng)過程中，如何平衡產(chǎn)品(產(chǎn)量/質(zhì)量)和培養(yǎng)基的量是大家研究的主要課題。選擇合適的培養(yǎng)基可以體現(xiàn)灌注培養(yǎng)的最大優(yōu)勢。目前灌注介質(zhì)主要有:商用、自制配方、廠家專門定制的介質(zhì)。

現(xiàn)有灌注培養(yǎng)項目中使用的商業(yè)培養(yǎng)基包括CHO-S-SFM二號、SFM4CHO、CDM4PerMab和ActiPro(含細(xì)胞助推器5或7)。通用電氣與客戶合作，通過使用商業(yè)培養(yǎng)基HyCell和ActiPro開發(fā)了許多灌注細(xì)胞培養(yǎng)項目。

在選擇合適的灌注介質(zhì)時，我們通常會經(jīng)歷以下步驟:

a.

首先篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇最佳基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

b.

設(shè)定不同的細(xì)胞特異性灌注率(CSPR)，并為每個cspr維持培養(yǎng)3-5天；

c.

上清液分析確認(rèn)主要營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，最后加入一定比例的飼料形成灌注培養(yǎng)基；

d.

基礎(chǔ)培養(yǎng)基與飼料的比例和灌注率在實際灌注培養(yǎng)中得到驗證和進一步優(yōu)化。

實際案例

在WAVE 25系統(tǒng)上，使用acti ho平臺(acticho p培養(yǎng)基、acti ho飼料a和acti ho飼料b)培養(yǎng)基進行灌注培養(yǎng)基的優(yōu)化。

灌注

穩(wěn)態(tài)條件

步驟1

圖4實驗策略圖解

在穩(wěn)態(tài)方法中

用大腸桿菌進行灌流培養(yǎng)，研究了不同條件下培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的變化。每次cspr保持3天后，取樣進行檢測。

廢媒體分析和

新媒體設(shè)計

步驟2

采集樣品進行上清液分析，觀察氨基酸等營養(yǎng)素的比例變化。灌注培養(yǎng)基通過添加一定比例的補充劑進行優(yōu)化。

根據(jù)乳酸菌飼料A和乳酸菌飼料B的營養(yǎng)成分，最終在乳酸菌飼料P中添加7%乳酸菌飼料A和1%乳酸菌飼料B作為灌注培養(yǎng)基。

灌注中的培養(yǎng)基驗證

步驟3

圖5以1 RV/d的速度進行灌注運行，以確定最大性能

通過灌注培養(yǎng)基確認(rèn)培養(yǎng)物，并將灌注速率設(shè)定為1 RV/d(反應(yīng)器體積/天)。根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果，選擇藍(lán)色部分作為最佳操作窗口(CV >: 50 MVC/mL，CSPR≈20 pL/c/d，qP≈30 pcd)。

穩(wěn)態(tài)下的確認(rèn)

步驟4

圖6 cspr = 20 pl/c/d時的穩(wěn)態(tài)條件

在灌注速率維持在1 RV/d的條件下，通過定期放細(xì)胞，使密度維持在50MVC/ml左右，使池內(nèi)條件達到相對穩(wěn)定的狀態(tài)，培養(yǎng)時間在允許范圍內(nèi)延長，最大限度地利用培養(yǎng)基和硬件設(shè)備，使效益最大化。

總結(jié)

隨著生物制藥行業(yè)的發(fā)展，灌注文化越來越被大家所接受。隨著設(shè)備和培養(yǎng)基的不斷升級，灌注培養(yǎng)在許多方面顯示出其優(yōu)勢，并將在生物制藥行業(yè)發(fā)揮重要作用。