最近遇到一客戶咨詢篩選內(nèi)參基因的問題，想想當(dāng)年小編也是遇到同樣的問題，今天就手把手教您如何選擇穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

為什么要選擇內(nèi)參基因呢？熒光定量PCR因其高度的靈敏性和特異性而被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)量分析。在qPCR實(shí)驗(yàn)中采用穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，可增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

何為內(nèi)參基因

管家基因是維持細(xì)胞生命活動所必需的一類基因，在所有組織細(xì)胞中均有表達(dá)，長久以來一直被用作內(nèi)參基因。然而，越來越多的證據(jù)顯示，管家基因在不同組織或細(xì)胞中表達(dá)并不恒定，而且在不同實(shí)驗(yàn)處理中最適內(nèi)參基因也有不同，因此選擇合適的內(nèi)參基因很重要。

如何選擇合適的內(nèi)參

常用的內(nèi)參篩選軟件有Genorm（version3.5）和Normfinder（version0.953），這兩個軟件都不能用原始Ct值數(shù)據(jù)，需按說明書進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后才能用軟件進(jìn)行計算。

Genorm數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換采用delta-Ct公式進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。

公式：

Q = E deltaCt= E(minCt - sampleCt)

Q = sample quantity relative to sample with highest expression

E = amplification efficiency (2 = 100%)

minCt = lowest Ct value = Ct value of sample with highest expression

數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換操作

新建Excel表格，行標(biāo)題為基因名稱，列標(biāo)題為樣本名稱，每個基因中表達(dá)量最高的值被設(shè)置為1，將計算得到的各樣本對應(yīng)各基因的數(shù)值輸入表格，將該文件保存成xls格式，關(guān)閉所有Excel程序，啟動Genorm程序（如下圖）；

導(dǎo)入轉(zhuǎn)換好的數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊Calculate按鈕，程序自動給出M值表格，紅色表示表達(dá)最不穩(wěn)定基因，綠色表示穩(wěn)定表達(dá)基因；逐步去除表達(dá)最不穩(wěn)定基因（紅色），直至剩下兩個最穩(wěn)定內(nèi)參基因。

再次點(diǎn)擊圖表上方柱形圖按鈕，將會給出配對變異Vn/n+1結(jié)果圖，該圖顯示需要內(nèi)參基因的數(shù)目，0.15為默認(rèn)閾值，如V2/3＜0.15表明2個內(nèi)參基因就夠了，如大于0.15表明需要額外的內(nèi)參基因進(jìn)行計算，一般來說2個內(nèi)參基因就夠了。

Normfinder數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換采用自然對數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，行標(biāo)題為樣本名稱，列標(biāo)題為基因名稱，數(shù)值為原始Ct值取自然對數(shù)。打開normfinder軟件（如下圖），用Selectinut data調(diào)用數(shù)據(jù)，勾選相關(guān)選項進(jìn)行計算。打開normfider軟件，點(diǎn)擊Getting Started會有詳細(xì)描述。

Genorm和Normfinder因算法不一致，得到的結(jié)果可能不一致，選擇一個兩個軟件都顯示比較穩(wěn)定的內(nèi)參基因即可。

注：如有需要此軟件，可私信小編。