抽象的

為建立黃曲霉毒素B1的靈敏免疫分析方法，篩選了一株分泌高親和力抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。合成了一種新型碲化鎘/硫化鎘/硫化鋅量子點(diǎn)，并將其與人工抗原偶聯(lián)，作為熒光探針用于簡單的一步熒光免疫分析。所研制的熒光分析儀可在0.08 ~ 1.97納克/毫升的寬線性范圍內(nèi)靈敏地測定糧食樣品中的黃曲霉毒素B1，糧食樣品的檢出限為0.01納克/毫升。克隆并測序了Fab片段的免疫球蛋白基因，成功驗(yàn)證了Fab在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)。黃曲霉毒素B1的分子量為1.09×10-7摩爾/升..

為了研究抗體與AFB1的相互作用，采用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)方法模擬了AFB1和Fab片段的同源模型。結(jié)果表明，Ser32、Trp93和Trp98殘基在氫鍵、π-π堆積/π-烷基相互作用和范德華相互作用中起著最重要的作用。此外，對(duì)AFB1的靜電勢研究表明，靜電相互作用在識(shí)別過程中也起著重要作用。理論結(jié)果為半抗原的設(shè)計(jì)和基因工程抗體的改良提供了指導(dǎo)。

同源性建模是利用信息技術(shù)的一種手段，可以從一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)直接預(yù)測蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)(主要是三級(jí)結(jié)構(gòu))。人們可以利用一種或多種已知的結(jié)構(gòu)蛋白(模板)來構(gòu)建未知結(jié)構(gòu)蛋白(靶蛋白)的空結(jié)構(gòu)。Discovery Studio通過使用同源建模的方法，為用戶提供了一套自動(dòng)預(yù)測蛋白質(zhì)之間空結(jié)構(gòu)的工具。用戶只需提供蛋白質(zhì)的氨基酸序列，即可輕松完成同源模型的構(gòu)建和模型可信度的評(píng)估。

分子對(duì)接是基于結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計(jì)的核心模擬方法，根據(jù)受體-配體相互作用的幾何匹配和能量匹配過程模擬受體-配體相互作用，預(yù)測二者之間的最佳結(jié)合方式和結(jié)合親和力。利用分子對(duì)接模擬技術(shù)，研究人員可以基于結(jié)構(gòu)對(duì)藥物進(jìn)行虛擬篩選，對(duì)藥物分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，研究配體-受體相互作用的機(jī)制，從而大大提高實(shí)驗(yàn)效率。在分子模擬綜合平臺(tái)Discovery Studio中，分子對(duì)接程序包括Libdock、CD locker和Flexible Docking。這三種對(duì)接算法各有優(yōu)勢，既能滿足研究者的各種應(yīng)用需求，又為他們提供了配體與受體之間相互識(shí)別的“利器”。

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碲化鎘/硫化鎘/硫化鋅量子點(diǎn)

黃曲霉毒素B1的免疫測定和抗體識(shí)別

分子模型中的應(yīng)用

參考:中國分析學(xué)報(bào)。2018年9月26日在線提供，中頻=5.256

鏈接:https://doi.org/10.1016/j.aca.2018.09.058

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研究背景

B1(AFB1)是一種真菌毒素，主要由寄生曲霉和黃曲霉在谷物成熟、收獲和儲(chǔ)藏過程中，在各種環(huán)境條件下產(chǎn)生。黃曲霉毒素B1污染食物鏈和環(huán)境，會(huì)對(duì)人類、家禽和家畜產(chǎn)生各種潛在的有害后果。如致癌、胚胎毒性、免疫抑制、致畸等。免疫分析因其適用性、靈敏度和快速反應(yīng)性，已成為短時(shí)間內(nèi)分析大量樣品的最常用方法。然而，熒光免疫分析法比傳統(tǒng)免疫分析法更靈敏，因此其利用率在不斷提高。同時(shí)，由于其獨(dú)特的光譜特性，鎘量子點(diǎn)作為熒光信號(hào)探針的使用也有所增加。如CdTe/CdS/ZnS量子點(diǎn)含有CdS和ZnS的殼層，不僅可以急劇增加熒光強(qiáng)度，還可以阻止有毒Cd2+的釋放，可以作為熒光探針，在細(xì)胞標(biāo)記和靶標(biāo)分析中具有廣闊的前景。

Fab的克隆和測序

用聚合酶鏈反應(yīng)從抗AFB1單克隆雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出Fd和LC基因，擴(kuò)增產(chǎn)物分別為660 bp和642 bp擴(kuò)增子。該基因由卡巴特?cái)?shù)據(jù)庫和發(fā)現(xiàn)工作室2016測序。結(jié)果表明，擴(kuò)增的VL基因?qū)儆贗GV1基因家族，而VH序列屬于IGV1基因家族。基因序列顯示無終止密碼子的框內(nèi)連接，表明序列重組正確，氨基酸序列相關(guān)。

單克隆抗體的Fab片段建模

利用Discovery Studio 2016軟件構(gòu)建了mAb 5A11C10A Fab片段的三維結(jié)構(gòu)。輕鏈和重鏈的模板結(jié)構(gòu)首先在PDB數(shù)據(jù)庫中通過BLAST搜索來識(shí)別。為了建模的準(zhǔn)確性，分別選擇1MFMB、3BSZ和3KS0的抗體晶體結(jié)構(gòu)作為整體、重鏈和輕鏈模板。然后通過在整個(gè)模板上疊加重鏈和輕鏈的模板來確定兩條鏈的相對(duì)空方向，從而構(gòu)建Fab片段的結(jié)構(gòu)。Ramachandran圖和Profile-3D分析用于驗(yàn)證Fab蛋白中預(yù)測的扭轉(zhuǎn)角。

分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬

為了研究AFB1抗體識(shí)別的特異性結(jié)合機(jī)制，作者在Discovery Studio中使用了半柔性分子對(duì)接方法CD Locker。結(jié)果表明，AFB1非常適合CDR區(qū)形成的疏水腔，說明基于幾何匹配原理，AFB1可以有效匹配Fab的活性位點(diǎn)，CDR區(qū)的殘基在AFB1抗體的識(shí)別中起著重要作用。氫鍵和π-π堆積/π-烷基相互作用是結(jié)合AFB1和Fab的關(guān)鍵相互作用。為了獲得更好的模擬結(jié)果，利用分子動(dòng)力學(xué)模擬了最佳對(duì)接模型，計(jì)算了AFB1和Fab的結(jié)合自由能。

結(jié)論

在本研究中，作者制備了一種新的抗黃曲霉毒素B1單克隆抗體，并合成了一種相對(duì)新的CdTe/CdS/ZnS三元量子點(diǎn)，可用于黃曲霉毒素B1的靈敏免疫分析，該三元量子點(diǎn)可作為熒光探針。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)相比，該方法的檢測限降低了4倍。然后，根據(jù)同源性建模方法，構(gòu)建Fab片段的三維同源性模型，進(jìn)行分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬，研究AFB1抗體的識(shí)別機(jī)制。這些方法可以幫助我們更好地理解半抗原抗體的識(shí)別機(jī)制，指導(dǎo)未來半抗原的設(shè)計(jì)，通過基因工程提高抗體。

圖1 (a) Fab表達(dá)和分子建模工作流程；(二)Fab三維模型和互補(bǔ)決定區(qū)；(c) Ramachandran圖和(fab域模型的剖面-3D分析；(e) Fab結(jié)合位點(diǎn)以及對(duì)接后Fab與AFB1的相互作用。

圖2 分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果圖圖2分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果

表1 Fab-AFB1復(fù)合物中每個(gè)殘基的相互作用能的分解值表1 FAB-AFB 1復(fù)合物中各殘基相互作用能的分解值

為什么選擇探索工作室

Discovery Studio提供一整套同源建模的工具，使用DS，可以輕松完成所有的同源建模過程，你腦闊模板識(shí)別、序列比對(duì)、自動(dòng)建模、模型的評(píng)估與優(yōu)化；Discovery Studio中同源建模工具可以預(yù)測多種類型生物大分子的結(jié)構(gòu)，包括：球蛋白、抗體、跨膜蛋白等；Discovery Studio中同源建模的核心程序是MODELER，該算法非常經(jīng)典，引用率比較高。Discovery Studio中共有三種對(duì)接程序，這三種對(duì)接算法各有優(yōu)勢，能夠滿足廣大科研工作者的多種應(yīng)用需求；Discovery Studio中有多種對(duì)接結(jié)果的評(píng)價(jià)分析手段，包括2D/3D相互作用圖分析（可以分析氫鍵、疏水作用、鹵鍵等多種非鍵作用類型）、結(jié)合口袋表面分析、氫鍵熱圖、多種打分函數(shù)、結(jié)合能的計(jì)算等；Discovery Studio應(yīng)用廣泛，操作簡便，圖形化界面十分友好，結(jié)果易于分析。