前言

目前，隨著國內(nèi)生物醫(yī)藥的迅速發(fā)展，越來越多的生物制藥企業(yè)的產(chǎn)品開發(fā)正在進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段。在生物制藥領(lǐng)域，質(zhì)量來自設(shè)計(QbD)，是一種系統(tǒng)的、結(jié)構(gòu)性的、科學(xué)的和基于風(fēng)險的藥物開發(fā)方法，是科學(xué)有效地管理產(chǎn)品、過程和分析方法的重要工具。目前，單航領(lǐng)域是生物制藥行業(yè)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，也是相對成熟的領(lǐng)域之一，QbD關(guān)于單航產(chǎn)品開發(fā)的報道越來越多。本文簡述了QbD在單抗產(chǎn)品細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝中應(yīng)用的概念和初步想法。

細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝

抗體藥物的原液生產(chǎn)大致可分為上游工藝(細(xì)胞培養(yǎng))、下游工藝(純化)，每一環(huán)都有核心技術(shù)，這些核心技術(shù)環(huán)環(huán)相扣，形成抗體藥物生產(chǎn)企業(yè)的核心競爭力。典型的單抗藥物商業(yè)化生產(chǎn)過程上游工藝(細(xì)胞培養(yǎng))一般采用細(xì)胞恢復(fù)和傳代擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞分離(可能屬于下游工藝)。

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細(xì)胞復(fù)蘇和傳代

將種子放入恒溫水浴鍋，一般溫度控制在35左右，預(yù)熱為30min，解凍工作細(xì)胞庫細(xì)胞，根據(jù)工藝要求調(diào)整解凍時間，然后將解凍細(xì)胞放入培養(yǎng)基，離心分離后轉(zhuǎn)移到搖瓶(如250 mL)，搖晃瓶子。在控制CO2濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間等的同時，要根據(jù)工藝的要求調(diào)整接種密度，控制細(xì)胞活率等。將上述復(fù)蘇種子細(xì)胞按一定密度稀釋到新的搖瓶(如500 mL/2000mL)中，調(diào)節(jié)溫度、CO2濃度、溶解氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、搖速、pH等因素，逐步擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)，以滿足一級種子罐的接種要求。

02

擴(kuò)增培養(yǎng)(也稱為種子培養(yǎng))

一級種子培養(yǎng)

將搖瓶種子細(xì)胞按一定密度接種到一級種子筒(如20 L)中，調(diào)節(jié)溫度、CO2濃度、溶解氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、攪拌速度、pH、培養(yǎng)基等，逐步擴(kuò)大到細(xì)胞數(shù)，以滿足二級種子筒的需要。

二次種子培養(yǎng)

將一級種子按一定密度接種到二級種子罐(如50 L)中，調(diào)整溫度、CO2濃度、溶解氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、攪拌速度、pH、培養(yǎng)基等，根據(jù)細(xì)胞數(shù)逐步擴(kuò)增，以滿足三級種子罐的接種要求。

三次種子培養(yǎng)

將二級種子按一定密度接種到三級種子罐(如100 L)中，并調(diào)整溫度、CO2濃度、溶解氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、攪拌速度、pH、培養(yǎng)基等，逐步擴(kuò)增，以滿足細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)的接種要求。

03

細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)(也稱為生物反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng))

種子增強后，要進(jìn)入細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)階段，控制溫度、CO2濃度、溶解氧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、攪拌速度、pH、培養(yǎng)基等因素。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，可以通過離心分離或凈化過濾等方法進(jìn)行抗體蛋白質(zhì)的分離純化。

基于QbD概念的細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)

質(zhì)量來自設(shè)計(QbD)的核心理念?！百|(zhì)量是通過科學(xué)合理的設(shè)計實現(xiàn)的，而不是僅僅依靠最終檢查?！睆?013年開始，美國FDA對新藥品批準(zhǔn)申請要求監(jiān)管部門采用QbD方法。近年來，QbD的理念是國內(nèi)企業(yè)大多數(shù)藥品生產(chǎn)及研發(fā)amp已成為D企業(yè)的共識，越來越多的報道用于單航產(chǎn)品的細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)，基于QbD理念的藥品開發(fā)的基本過程ICH Q8中提到的質(zhì)量來自于QbD的設(shè)計方法。

基于QbD理念的細(xì)胞培養(yǎng)過程開發(fā)：首先，要將目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量概述(QTPP)確定為預(yù)定目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量摘要(QTPP)作為研發(fā)的起點，在理解核心物質(zhì)屬性(CMA)的基礎(chǔ)上，通過實驗設(shè)計(DOE)了解產(chǎn)品的主要質(zhì)量屬性(DOE)。建立滿足產(chǎn)品性能的強大設(shè)計空間(DS)，根據(jù)設(shè)計空間建立質(zhì)量風(fēng)險管理，建立質(zhì)量管理戰(zhàn)略和藥品質(zhì)量體系，整個過程強調(diào)對產(chǎn)品和生產(chǎn)的認(rèn)識。QbD有助于更好地理解產(chǎn)品和流程，提高單航產(chǎn)品的穩(wěn)定性，降低GMP生產(chǎn)的復(fù)雜性和成本等。

那么，細(xì)胞培養(yǎng)過程中設(shè)計空間是如何確定的，一直是備受關(guān)注的主題。從2021年6月25日開始，CDE發(fā)布《已上市生物制品藥學(xué)變更研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，正式在官方指導(dǎo)原則中提及設(shè)計空間的概念，一石激起千層浪，現(xiàn)在我將分享細(xì)胞培養(yǎng)過程中確定設(shè)計空間的過程。如果由于個人認(rèn)知的局限性而不足，細(xì)胞培養(yǎng)工作區(qū)通常在注冊人注冊時提交，CDE等管理機(jī)構(gòu)進(jìn)行評估和批準(zhǔn)，在設(shè)計空間的確定過程中，必須量化各種參數(shù)對工藝產(chǎn)品性能的影響。例如：根據(jù)產(chǎn)量、質(zhì)量和影響程度，通常分為不重要的流程參數(shù)(Non-KPP)、重要的流程參數(shù)(KPP)。

供參考），

01

評估細(xì)胞培養(yǎng)過程中所有工藝過程參數(shù)

首先以適當(dāng)?shù)脑u估工具（如FMEA）評估細(xì)胞培養(yǎng)過程中所有工藝過程參數(shù)，確定細(xì)胞培養(yǎng)工藝表征中需要研究的參數(shù)，因不同生物制品自身特點不同，細(xì)胞培養(yǎng)過程中工藝過程參數(shù)也會有所差別，評估后的工藝表征中需要研究的參數(shù)也會有所差別。因此相關(guān)研究人員須具備足夠的培養(yǎng)工藝知識積累、風(fēng)險評估和風(fēng)險管控的能力。在實施評估時，基于風(fēng)險，前瞻性設(shè)計研究方案，開展充分的研究，不同階段細(xì)胞培養(yǎng)，評估的參數(shù)對象也會有所差別，一般情況下分細(xì)胞復(fù)蘇與傳代、各級種子培養(yǎng)、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)分別進(jìn)行評估細(xì)胞培養(yǎng)過程相關(guān)工藝過程參數(shù)，如某藥企大規(guī)模生產(chǎn)階段細(xì)胞培養(yǎng)過程相關(guān)工藝過程參數(shù)如下表：

02

建立工藝縮小模型

其次建立工藝縮小模型；在縮小模型基礎(chǔ)上，進(jìn)行試驗設(shè)計（DOE）參數(shù)篩選實驗，去除非重要工藝參數(shù)（Non-KPP），確定重要工藝參數(shù)（KPP），對影響產(chǎn)品質(zhì)量的參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計（RSM）實驗設(shè)計，建模，確定關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）操作空間，如在風(fēng)險評估階段確定了生產(chǎn)培養(yǎng)步驟中的4個潛在的關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）(IVCD、Culture duration、pH和Temperature)，最后進(jìn)行最差條件實驗進(jìn)行操作空間確認(rèn)，確認(rèn)的范圍如下表：